T-GXAS 781-2024 肉類產品動物源性成分檢測方法 擴增子測序法

GXASI本文件參照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定本文件起草單位：廣西壯族自治區(qū)藥品檢驗研究院、廣西-東盟食品檢驗檢測中心、廣西愛生生命本文件主要起草人：甘永琦、張贊、朱斌、樊蘭艷、韋濤、陳曉東、王逸叢、巫堅、羅衛(wèi)姚雪瑩、譚慧敏、黃曉韻、陳曉春、鄭義友、薛亞馨、蘆志龍1肉類產品動物源性成分檢測方法擴增子測序法測，以及同類型動物組織制成的肉類產品中動物成分的定量檢測。檢出限為0.1%，定量限為5%（質量分GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格GB/T30989高通量基因測序技GB/T40226環(huán)境微生物宏基因組檢測高通量測GB/T40664—2021用于高通量測序的核酸類樣本質量控制通用SN/T3500進出口食品安全生T/CSES81淡水生物監(jiān)測環(huán)境DN擴增子測序ampliconsequ高通量基因測序high-throughputge堿基識別質量qualityofbasecal2生物體細胞核或者細胞器中能夠代表該物種的線粒體基因組上編碼核糖體小亞基16Sr操作分類單元operationaltaxonomicun分子分類單元molecularta4縮略語CTAB：十六烷基三甲基溴化銨（CetyltrimetDNA：脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcNa2EDTA：乙二胺四乙酸二鈉（EthylenediaminetetraaceticaTris：三（羥甲基）氨基甲烷[Tris（hydroxymethyl）Aminometha結合DNA條形碼技術與高通量測序技術對樣品中動物除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純。實驗用水）：3）：），）：），）：8.12冰箱：-20℃和2℃~8℃。9樣品采集與處理9.1樣品采集應使用不同的采樣器具采集不同的樣品。采樣抽樣按GB/T9695.19和SN/T3500的9.2樣品處理9.2.1肉品、內臟、角骨、皮張9.2.2毛發(fā)4取0.5g樣品中入50mL離心管，加入2倍體積的無菌水（7.20），上下顛倒充分混勻，8500rpm離心5min并棄去上清液，重新加入2倍體積的無菌水（7.20），上下顛倒充分混勻，8500rpm離心5min），），），置20min，12000rpm離心10min），的RNaseA（7.6），輕彈均勻后，37℃酶解作用30min；DNA置于-注：上述方法均可使用等效的DNA提取試劑盒提取樣品DNA。正向引物PR2-F和反向引物PR2-R（見表1）用于擴增各樣品16SrDNA的目標片段。在擴增引物PR2引物序列5’-3’ATAAGACGAGAAGACCCTACATCGAGGTCGTAAACC在冰上（-10℃~0℃)制備以下PCR反應液并混勻：PCR聚合酶混合液（7.4）12.5μL、正反向引5稱取適量的瓊脂糖（7.13）粉末，加入電泳緩沖液，使瓊脂糖終濃度為1％，充分溶化，加入核酸染料（7.12制膠。取2μLPCR擴增產物和適量加樣緩沖液（7.11）混合，點樣，9V/c個質檢合格的文庫按比例混合后，選擇合適的測序讀長進別質量（一般＞Q20）和序列長度（一般大于預期長度的70進行序選用OTU方法進行序列聚類和質量控制，獲得分子分類單元，并過濾錯誤序列。將相似性高于或等％）6品中檢測出XX動物源性成分，物種占比為X%，空白對照檢測結果正?！?。a)檢測機構名稱、聯系方式和地址、檢測員、樣品接收時間及報告時間；b)測序平臺與測序策略。7A.1.1將AMPureXP磁珠（7.1）于室溫放置30min。使用前渦旋AMPureXP磁珠（7.A.1.5在室溫下靜置孵育10min。A.1.6將1.5mL離心管或微孔板置于磁力架上，室溫放置2min，直至上清液澄清。A.1.7吸取上清液并丟棄，勿觸碰磁珠。A.1.8將1.5mL離心管或微孔板置于磁力架上，用新制備的80％乙醇（7.18）洗滌磁珠，操作如下：c)小心吸取并丟棄上清液，勿觸碰磁珠。A.1.9重復步驟A.1.8一次，A.1.10在室溫下將離心管或微孔板置于磁力架上晾干10min～15min。A.1.12輕輕上下吸吹10次，確保磁珠再懸浮。A.1.13將離心管或平板在室溫下孵育5min。A.1.14將離心管或平板置于磁力架上至少5min，直至上清液澄清。A.1.16進行下一步實驗或置于-25℃~-15℃下儲存。A.2文庫定量A.2.3文庫通過質檢后，進行下一步實驗或置于-25℃~-15℃下儲存。A.3文庫均一化和混合A.3.1根據PCR擴增子的大小計算DNA濃度C(nMA.4文庫變性8A.4.1取200μL氫氧化鈉溶液（7.7）加入800μL水，混勻，制備成0.2效。從測序試劑盒中拿出HT1恢復至室溫，儲存在2℃~8℃,直到變性樣品。A.4.6根據表A.1將變性的20pM文庫稀釋到想要的濃度，推薦濃度A.4.7輕輕漩渦，再輕離心。A.5.1混合上述變性的PhiX質控和變性的擴增文庫，推薦擴增文庫占比為5070％。例如：變性的A.5.3輕輕漩渦，立即放置冰上。A.6測序儀運行設置A.6.2根據測序需要設置相應工作流程參數：a)標準測序（可獲得完整的擴增子序列2)SamplePrepKit：選擇“NexteraXT4)ReadType：選擇“PairedEn5)CyclesRead1：201Cycl2)SamplePrepKit：選擇“NexteraXT4)ReadType：選擇“SingleEn9B.1.1正向引物PR2-F和反向引物PR2-R用于擴增各樣品的目標片段，Spike-in-1F、Spike-in-1R和在擴增引物PR2、Spike-in-1、Spike-in-2的5’端和3’端加入標簽序列和測序接頭以區(qū)分不同樣品；B.1.3將制備好的反應液放置PCR儀中進行f)進行下一步實驗或置于-25℃~-15℃下儲存。B.2.1將DNACleanBeads磁珠（7.1）于室溫放置30min。使用前渦旋DNACleanBB.2.5在室溫下靜置孵育10min。B.2.6將離心管或微孔板置于磁力架上，室溫放置2min～5min，直至上清液澄清。B.2.8將1.5mL離心管或微孔板置于磁力架上，用新制備的80％乙醇（7.18）洗滌磁珠，操c)小心吸取并丟棄上清液，勿觸碰磁珠。B.2.10將離心管或微孔板置于磁力架上，室溫干燥至磁珠表面無反光、無B.2.13將離心管或平板在室溫下孵育5min。B.2.14將離心管或平板置于磁力架上，室溫放置2min～5min，直至上清液澄清。B.2.16進行下一步實驗或置于-25℃~-15℃下儲存。布，預期大小約為380bp。B.3.3文庫通過質檢后，進行下一步實驗或置于-25℃~-15℃下儲存。n——單個文庫取樣量，單位為納克（ngM——單個反應所需混合文庫的總量，單位為納克（ngN——所需測序文庫數目。v——單個文庫取樣體積，單位為微升(n——單個文庫取樣量，單位為納克（ngB.4.2當樣品量大時，為減少取樣誤差，可進行X倍的混合文庫方案后，取1/X進行后續(xù)的一步法DNBB.