臨床常見微生物的鑒定-需氧和兼性厭氧性球菌鑒定

第三節(jié)腸球菌屬

是腸道中的正常菌群導(dǎo)致醫(yī)院內(nèi)感染：如尿路感染、腹部和盆腔感染、敗血癥、腦膜炎。一、生物學(xué)特性（一）形態(tài)染色

G+球菌，單個(gè)、成雙或短鏈狀排列。無莢膜、芽胞，部分菌株有鞭毛。營養(yǎng):要求較高。能在高鹽（6.5%NaCl）、

高堿（PH9.6）、高膽汁（40%）、

10-45℃均可生長。菌落：圓形、中等大小、灰白色、不透明、

S型，有γ或α溶血。（二）培養(yǎng)特性能分解多種糖類觸酶（-）PYR（吡咯烷酮-β-萘基酰胺）試驗(yàn)（+）（三）生化反應(yīng)目前分21種。引起醫(yī)院內(nèi)感染常見的是糞腸球菌和屎腸球菌。常用的分型方法：rRNA基因探針分型法。（四）分型（五）抵抗力對理化因素抵抗力弱。但對大多數(shù)抗生素天然耐藥。頭孢菌素、克林霉素、復(fù)方增效磺胺、低濃度氨基糖甙類和萬古霉素天然耐藥。易形成獲得性耐藥。二、微生物學(xué)檢驗(yàn)（一）標(biāo)本采集

尿液、血液、腦脊液、膿汁分泌物等。（二）檢驗(yàn)程序尿液、膿汁、穿刺液血液涂片染色分離培養(yǎng)（血平板）初報(bào)挑選可疑菌落增菌培養(yǎng)（葡萄糖肉湯）PYR試驗(yàn)?zāi)懼呷~苷試驗(yàn)6.5%NaCl生長試驗(yàn)血清學(xué)試驗(yàn)其他鑒定試驗(yàn)報(bào)告（三）檢驗(yàn)方法1、直接鏡檢適用于：痰、膿、腦脊液、穿刺液標(biāo)本。2、分離培養(yǎng)血平板：灰白色，圓形，中等大小，不透明，S型菌落，周圍有α溶血或γ溶血。選擇培養(yǎng)基：疊氮膽汁七葉苷瓊脂平板。3、鑒定試驗(yàn)（1）菌屬鑒定試驗(yàn)：①PYR試驗(yàn)：腸球菌、A群鏈球菌、某些凝固酶陰性葡萄球菌為（+）②膽汁七葉苷試驗(yàn)：+③鹽耐受試驗(yàn)：+（2）種間鑒定試驗(yàn)：第二節(jié)鏈球菌屬

(Streptococcus)一、生物學(xué)特性（一）形態(tài)與染色G+，球形或橢圓形，呈鏈狀排列，無鞭毛、無芽胞，有莢膜。一、生物學(xué)特性（二）培養(yǎng)特性條件：營養(yǎng)要求較高，多數(shù)為兼性厭氧菌，少數(shù)專性厭氧,5%CO2。液體：沉淀生長（絮狀或顆粒狀）。血液瓊脂平板：

鏈球菌在血平板上菌落特征甲鏈乙鏈丙鏈（三）生化反應(yīng)

活潑

分解多種糖類、蛋白質(zhì)、氨基酸。菊糖（-）膽汁溶菌試驗(yàn)（-）

optochin敏感試驗(yàn)（-）觸酶（-）（區(qū)別于葡萄球菌屬）（區(qū)別甲鏈與肺鏈）（四）抗原構(gòu)造１、多糖抗原（C抗原）：群特異性。２、蛋白抗原（M、T、R、S）型特異性，M蛋白抗原是與致病有關(guān)的主要物質(zhì)，引起超敏反應(yīng)。多糖抗原蛋白質(zhì)抗原核蛋白抗原鏈球菌抗原構(gòu)造模式圖莢膜（五）分類

１、按溶血情況分類：（1）甲型溶血性鏈球菌：條件致病菌。（2）乙型溶血性鏈球菌：致病力強(qiáng)，引起多種疾病。（3）丙型鏈球菌：無溶血環(huán)，不致?。病纯乖Y(jié)構(gòu)分類：按多糖抗原分群：ABCD…20群，對人致病的以A群為主。3、按對氧的需求分型：需氧菌、厭氧菌、兼性厭氧菌。（六）抵抗力不強(qiáng)，60℃30min殺死，對多種消毒劑敏感。乙鏈：對青霉素、四環(huán)素、紅霉素等敏感。肺炎鏈球菌：PRSP和多重耐藥。其他群的細(xì)菌：對青霉素耐藥頻度增加。（七）變異性肺炎鏈球菌莢膜變異：有莢膜的光滑（S）型菌有毒力，失去莢膜的粗糙（R）型毒力減低或消失。二、致病性和免疫性（一）致病物質(zhì)

1、鏈球菌溶血素（1）鏈球菌溶血素O(SLO):SLO抗體

抗鏈球菌溶血素O試驗(yàn)：協(xié)助診斷風(fēng)濕熱（>1:400)

（2）鏈球菌溶血素S(SLS)：無抗原性。2、致熱外毒素（猩紅熱毒素/紅疹毒素）3、M蛋白4、透明質(zhì)酸酶5、鏈激酶6、鏈道酶（二）所致疾病

主要由A群鏈球菌引起。

1、化膿性感染：由皮膚傷口侵入，經(jīng)呼吸道侵入，其他途徑（如產(chǎn)褥熱、蜂窩組織炎）特點(diǎn)：病灶界限不清,膿汁稀薄2．中毒性疾?。盒杉t熱。由產(chǎn)生致熱外毒素的A族鏈球菌所致的急性呼吸道傳染病。3．變態(tài)反應(yīng)性疾?。猴L(fēng)濕熱、急性腎小球腎炎

4．其他疾?。杭仔停ú菥G色）鏈球菌：引起亞急性細(xì)菌性心內(nèi)膜炎。B群、D群：正常菌群，引起呼吸道、泌尿道感染或菌血癥、敗血癥等感染。C群：咽喉炎的病原菌肺炎鏈球菌分85型，對人致病的有20多型。Ⅰ-Ⅲ型引起大葉性肺炎。還可引起胸膜炎、膿胸，、慢性支氣管炎、中耳炎、腦膜炎、敗血癥等。三、微生物學(xué)檢驗(yàn)（一）標(biāo)本采集（二）檢驗(yàn)程序（三）檢驗(yàn)方法（一）標(biāo)本采集根據(jù)病情采集標(biāo)本種類：膿液、鼻咽拭子、血液等風(fēng)濕熱查血清抗體（二）鏈球菌的檢驗(yàn)程序痰、膿、穿刺液咽拭子等腦脊液血液直接涂片染色測抗原分離培養(yǎng)增菌培養(yǎng)(5%CO2葡萄糖肉湯)血平板（5%CO2）可疑菌落鑒定試驗(yàn)初步報(bào)告血清學(xué)鑒定（分群）桿菌肽試驗(yàn)optochin膽汁溶菌試驗(yàn)其他鑒定敏感試驗(yàn)試驗(yàn)肺炎鏈球菌檢驗(yàn)程序痰、膿腦脊液血液直接涂片分離培養(yǎng)革蘭染色、美蘭染色莢膜腫脹試驗(yàn)增菌培養(yǎng)（葡萄糖肉湯、硫酸鎂肉湯）（血平板）挑選可疑菌落純培養(yǎng)初報(bào)兔血清肉湯小白鼠毒力試驗(yàn)涂片莢膜腫脹試驗(yàn)?zāi)懼芫囼?yàn)菊糖發(fā)酵Optochin試驗(yàn)藥敏試驗(yàn)報(bào)告（三）鏈球菌的檢驗(yàn)方法（1）直接鏡檢：（痰、膿、穿刺液、咽拭子等）初報(bào)：發(fā)現(xiàn)G+球菌，呈鏈狀排列

（2）分離培養(yǎng)：①血液、腦脊液肉湯增菌

②膿液、咽拭子等血平板分離（3）鑒定鏈球菌的主要試驗(yàn)：根據(jù)形態(tài)、菌落、溶血情況進(jìn)行：①桿菌肽敏感試驗(yàn)：A群敏感(d>10mm)②Optochin敏感試驗(yàn)：肺炎鏈球菌d>18mm，

d<15mm為陰性。③膽汁溶菌試驗(yàn)：肺炎鏈球菌+

④CAMP試驗(yàn)：Ｂ群無乳鏈球菌為＋

⑤PYR試驗(yàn)：A群鏈球菌陽性膽汁溶菌試驗(yàn)陽性：加入膽汁或10%去氧膽酸鈉，37℃，5-10min，激活本菌的自溶酶，出現(xiàn)溶菌現(xiàn)象。Optochin敏感試驗(yàn)陽性：取肉湯培養(yǎng)液均勻涂于血平板上用optochin紙片貼于接種區(qū)中央（或分區(qū)劃線法，紙片貼于1-2區(qū)），35℃需氧培養(yǎng)過夜，抑菌圈>18mm。⑥血清學(xué)鑒定：⑦抗O試驗(yàn)：風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、急性腎小球腎炎，效價(jià)>400為+⑧膽汁七葉苷試驗(yàn)：D群鏈球菌陽性肺炎鏈球菌與甲型溶血性鏈球菌的鑒別形態(tài)菌落血清膽汁菊糖Opto-小鼠肉湯溶菌chin毒力試驗(yàn)肺鏈甲鏈矛頭狀，稍大，濕潤渾濁++++成雙，扁平，有莢膜臍窩狀圓形，較小，稍干，沉淀—

—

—

—無莢膜圓，凸起（四）結(jié)果評價(jià)和報(bào)告

乙型溶血性鏈球菌和肺炎鏈球菌為毒力強(qiáng)的致病菌，無論從任何臨床標(biāo)本中分離出均應(yīng)報(bào)告臨床。及時(shí)鑒定和報(bào)告咽部標(biāo)本中分離出的化膿性鏈球菌，有利于早期治療，以減少并發(fā)癥（如風(fēng)濕熱，腎小球腎炎）的產(chǎn)生。草綠色鏈球菌在重癥感染時(shí)，應(yīng)鑒定到種。需氧和兼性厭氧球菌對人有致病性的球菌主要引起化膿性炎癥,又稱化膿性球菌。G+：葡萄球菌、鏈球菌、肺炎鏈球菌、腸球菌G-:腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、卡他布蘭漢菌葡萄球菌屬

(Staphylococcus)分布廣泛，多為非致病菌。模式種：金黃色葡萄球菌（S.aureus）。（一）形態(tài)與染色

G+，球形，無鞭毛、無芽孢，呈葡萄串狀排列。一、生物學(xué)特性（二）培養(yǎng)特性營養(yǎng)：要求不高，某些菌株耐鹽(10-15%)。普通瓊脂平板、血液瓊脂平板生長特點(diǎn)不同。

液體：均勻渾濁生長。金黃色葡萄球菌：高鹽甘露醇平板為淡橙黃色菌落；羊血瓊脂平板為金黃色菌落。

金黃色葡萄球菌菌落特征（高鹽甘露醇平板）金黃色葡萄球菌菌落特征（血平板）中等大，突起，有色素，S型菌落。葡萄球菌菌落形態(tài)（普通瓊脂平板）金黃色葡萄球菌表皮葡萄球菌金黃色葡萄球菌有透明溶血環(huán)。表皮葡萄球菌無溶血環(huán)。（三）生化反應(yīng)

活潑，分解多種糖類、蛋白質(zhì)、氨基酸。(如：葡萄糖，麥芽糖，蔗糖，甘露醇）

分解甘露醇、產(chǎn)生血漿凝固酶、耐熱核酸酶陽性是致病菌的主要特征。

觸酶（＋）（區(qū)別于鏈球菌屬）血漿凝固酶試驗(yàn)［原理］致病性葡萄球菌能產(chǎn)生２種血漿凝固酶：一種為結(jié)合型凝固酶，細(xì)菌表面的纖維蛋白原受體與血漿中的纖維蛋白原結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)菌凝集。另一種為游離型凝固酶，可被人或兔血漿中的協(xié)同因子激活，成為凝血酶樣物質(zhì)，使纖維蛋白原變?yōu)槔w維蛋白，從而使血漿凝固。

［檢測方法］結(jié)合型凝固酶：玻片法游離型凝固酶：試管法玻片法操作：（1）準(zhǔn)備玻片（2）金葡白葡（3）滴加兔血漿（4）觀察結(jié)果試管法操作：耐熱核酸酶試驗(yàn)液體培養(yǎng)物煮沸15min

37℃3h甲苯胺藍(lán)核酸瓊脂（四）抗原構(gòu)造１、蛋白抗原（staphylococcalproteinA,ＳＰＡ）只存在于金黃色葡萄球菌表面。２、多糖抗原

金黃色葡萄球菌：核糖醇磷壁酸（檢測磷壁酸Ａｂ有助于金葡菌感染診斷）凝固酶（－）葡萄球菌：甘油磷壁酸葡萄球菌A蛋白（SPA）的意義：（1）降低抗體的調(diào)理作用，抗吞噬（2）協(xié)同凝集試驗(yàn):輔助診斷疾病。SPA的檢測模式示意圖致病性葡萄球菌（SPA)兔抗羊紅細(xì)胞Ab（IgGFc）SRBC致敏羊紅細(xì)胞（五）分類:３5個(gè)種及亞種１、按色素分類：金、白、檸２、按凝固酶分類：凝固酶陰性、凝固酶陽性葡萄球菌３、按噬菌體分類：

4、據(jù)色素、生化反應(yīng)分：金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、溶血性葡萄球菌（六）抵抗力無芽胞菌中最強(qiáng)，耐熱、耐干燥、耐高鹽，對石炭酸、升汞、龍膽紫敏感。易產(chǎn)生耐藥性變異，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillinresistantstaphylococcus,MRSA）。MRSA常呈多重耐藥，成為醫(yī)院感染的常見菌。

長期住院、反復(fù)使用各種廣譜抗菌藥物、燒傷或有傷口的病人及與MRSA定植或感染的病人接觸都是造成院內(nèi)MRSA流行的危險(xiǎn)因素。MRSA定植或感染的人員及院內(nèi)環(huán)境污染是引起院內(nèi)流行的主要來源。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）MRSA對所有頭孢菌素類、青霉素類、碳青霉烯類和內(nèi)酰胺酶抑制劑類等抗生素耐藥，對氨基糖甙類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素常協(xié)同耐藥。體外頭孢藥敏試驗(yàn)敏感也不宜報(bào)告。目前敏感藥物：萬古霉素、替考拉寧、氟喹諾酮類的環(huán)丙沙星以及利福平和復(fù)方磺胺甲噁唑。二、致病性和免疫性(一)致病物質(zhì)金黃色葡萄球菌產(chǎn)生多種侵襲性酶與外毒素。

1．血漿凝固酶（coagulase)：結(jié)合型凝固酶、游離型凝固酶。

鑒別金黃色葡萄球菌的重要指標(biāo)。3．殺白細(xì)胞素4．腸毒素：（A、B、C1、C2、C3、D、E、G、H9個(gè)血清型）5．表皮剝脫毒素6.毒性休克綜合征毒素1（toxicshocksyndrometoxin1,TSST1）2．葡萄球菌溶血素（二）所致疾病

金黃色葡萄球菌

1．侵襲性疾?。海?）皮膚軟組織感染

特點(diǎn)：病灶局限且膿汁粘稠

（2）內(nèi)臟器官感染（3）全身感染（4）尿路感染2．毒素性疾?。?）食物中毒（2）燙傷樣皮膚綜合征由表皮剝脫毒素引起。（3）葡萄球菌性腸炎人類凝固酶陰性葡萄球菌（CNS）感染中以表皮葡萄球菌的感染最為常見。

CNS主要引起以下幾種感染：泌尿系感染，細(xì)菌性心內(nèi)膜炎，敗血癥等，其中大多為醫(yī)院內(nèi)感染。此外，心臟起搏器安裝、置換人工心臟瓣膜、長期腹膜透析、靜脈滴注等亦可造成凝固酶陰性葡萄球菌的感染。凝固酶陰性葡萄球菌的致病性三、微生物學(xué)檢驗(yàn)（一）標(biāo)本采集（二）檢驗(yàn)程序（三）檢驗(yàn)方法三、微生物學(xué)檢驗(yàn)（一）標(biāo)本采集：根據(jù)病情采集標(biāo)本種類：膿液、傷口分泌物、穿刺液、血液、尿液、痰液、腦脊液、糞便等。注意：無菌操作，避免污染。（二）葡萄球菌檢驗(yàn)程序膿液、咽拭子、穿刺液尿液、痰液腦脊液血液糞便、嘔吐物直接涂片染色增菌培養(yǎng)分離培養(yǎng)（血平板）分離培養(yǎng)（高鹽甘露醇平板）取可疑菌落鑒定試驗(yàn)藥敏試驗(yàn)涂片染色血漿凝固酶耐熱核酸酶其他鑒定試驗(yàn)報(bào)告初報(bào)（三）檢驗(yàn)方法

1、直接涂片重要價(jià)值：正常情況下無菌的標(biāo)本（如腦脊液）伴有炎癥細(xì)胞的其他體液標(biāo)本、膿液等初步報(bào)告：

“查見革蘭陽性葡萄狀排列球菌，疑為葡萄球菌”或：“查見類似葡萄球菌的革蘭陽性球菌”

2、分離培養(yǎng)

50ml葡萄糖肉湯（增菌）

渾濁無菌（7天）報(bào)告：無菌生長腦脊液、膿液、穿刺液、咽拭、尿液血平板血液標(biāo)本5ml糞便、嘔吐物高鹽甘露醇平板（三）檢驗(yàn)方法3、鑒定試驗(yàn)（1）血漿凝固酶試驗(yàn)：金黃色葡萄球菌（+）（2）甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)：金黃色葡萄球菌（+）（3）耐熱核酸酶試驗(yàn)：金黃色葡萄球菌（+）（４）腸毒素測定：金黃色葡萄球菌產(chǎn)生（5）SPA檢測：金黃色葡萄球菌（6）凝固酶陽性和凝固酶陰性的葡萄球菌鑒定（7）葡萄球菌鑒定試劑盒腸毒素測定病人嘔吐物、糞便、剩余食物高鹽肉湯37℃24h分離培養(yǎng)肉湯煮沸30min，離心，取上清夜幼貓觀察癥狀（4h出現(xiàn)）幾種常見葡萄球菌的鑒別細(xì)菌菌落顏色溶血觸酶凝固酶甘露醇新生霉素

金黃色金黃色β+++S葡萄球菌表皮葡萄白色γ+--S球菌溶血葡萄白色β+--S/R球菌腐生葡萄檸檬黃γ+--R球菌Staphylococcusaures

（S）表皮葡萄球菌（S）腐生葡萄球菌(R)陰性結(jié)果>16mm（S）新生霉素耐藥試驗(yàn)（四）結(jié)果評價(jià)和報(bào)告1、金黃色葡萄球菌：無論任何標(biāo)本中分離到均應(yīng)鑒定并報(bào)告臨床。2、表皮葡萄球菌及腐生葡萄球菌：從輸液導(dǎo)管、人工植入組織中分離到，應(yīng)視為致病菌。3、尿培養(yǎng)計(jì)數(shù)：>103-104為陽性菌尿標(biāo)準(zhǔn)。4、其他