DB12T 843-2018 綠豆源成分檢測定性PCR法　　

2018-11-07發(fā)布2018-12-01實(shí)施I本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由天津市農(nóng)村工作委員會提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所、浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所、天津市東麗區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：蘭青闊、陳笑蕓、王成、趙新、蘭璞、王永、王慶平、汪小福、黃鳳軍、秦志揚(yáng)。1綠豆源成分檢測定性PCR法凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3術(shù)語和定義5.1除非另有說明，僅使用分析純試劑和重蒸餾水或符合GB/T6682規(guī)定的一級水。5.21mol/L氫氧化鈉溶液：在160mL水中加入8.0g氫氧化鈉(NaOH),溶解后，冷卻至室溫，再加水定容到200mL。5.3CTAB-Abuffer:將4g十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)、16.4g氯化鈉(NaC1)、3.15g三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HC1)、1.5g乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)依次加入到100mL無菌去離子水中，用1mol/L氫氧化鈉溶液(見5.1)調(diào)pH至8.0,加水定容至200mL。在103.4kPa(121℃)條件下滅菌15min。5.4CTAB-Bbuffer:將1g十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)、0.5g氯化鈉(NaCl)、依次加入到100mL無菌去離子水中，用1mol/L氫氧化鈉溶液(見5.1)調(diào)pH至8.0,加水定容至200mL。在103.4kPa(121℃)條件下滅菌15min。2調(diào)pH至8.0,加水定容至100mL。在103.4kPa(121℃)條件下滅菌20min。溶解于800mL水中，用鹽酸調(diào)pH至8.0,加水定容至1000mL。在103.4kPa(121℃)條件下滅菌5.9TE緩沖液(pH8.0):分別量取10mL三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液(見5.7)和2mL乙二胺四乙酸二鈉溶液(見5.6),加水定容至1000mL。在103.4kPa(121℃)條件下滅菌20min。5.1110g/L溴化乙錠(EB)溶液：稱取1.0g溴化乙錠，溶解于100mL水中，避光保存。溴化乙錠5.1250×TAE緩沖液：稱取242.2g三羥甲基氨基甲烷(Tris),先用500mL水加熱攪拌溶解后，加入100mL乙二胺四乙酸二鈉溶液(見5.6),用冰乙酸調(diào)pH至8.0,然后加水定容到1000mL。使5.13加樣緩沖液：稱取250.0mg溴酚藍(lán)，加入10mL水，在室溫下溶解12h;稱取250.0mg二甲mL,在4℃下保存?！狹ungbean_470bp_F:5'-TGAATGAGAGTGGTGTGAGTGAGA-3——Mungbean_470bp_R:5'-CCGCGAGTATTATTGATGGTAGG-5.18引物溶液：用TE緩沖液(見5.8)或水分別將上述引物稀釋到10μmol/L。6儀器6.1分析天平：重感0.1g和0.1mg。6.2PCR擴(kuò)增儀：升降溫速度>1.5℃/s,孔間溫度差異<1.0℃。37分析步驟7.1DNA提取buffer,充分混勻；加入20μL蛋白酶K(20mg/mL),充分混勻，65℃水浴1h,間期混勻三次；加入20μLRNaseA(10mg/mL),充分混勻，65℃水浴10min;16000g離心10min;轉(zhuǎn)移上清液至新的2.0mL離心管中，加入500μL三氯甲烷，混勻30s;16000g離心10min;轉(zhuǎn)移500μL上清液至新的2.0mL離心管中，加入500μL三氯甲烷，混勻30s;16000g離心5min,轉(zhuǎn)移上清液至新的2.0mL離心管中，加入2倍體積的CTAB-Bbuffer,吹打混勻，室溫靜置60min;16000g離心5min,棄上清液；沉淀中加入350μL1.2mmol/LNaCl,再加入350μL三氯甲烷，混勻30s;16000g離心10min,轉(zhuǎn)移上清液至新的潔凈2.0mL離心管中；加入0.6倍體積的異丙醇，充分混勻；16000g離心10min,棄上清液；加入500μL70%乙醇，顛倒混勻；16000g離心10min,棄上清液；室溫靜置至管內(nèi)水分完全蒸發(fā)，加入100μL無菌去離子水溶解沉淀，所得溶液即為綠豆DNA,-20℃貯存?zhèn)溆谩?.3PCR擴(kuò)增7.3.1.1每一個試樣PCR反應(yīng)設(shè)置3次重復(fù)。7.3.1.2在PCR反應(yīng)管中按附錄B依次加入反應(yīng)試劑，混勻，再加25μL石蠟油(有熱蓋設(shè)備的PCR儀可不加)。7.3.1.3將PCR管放在離心機(jī)上，500g~3000g離心10s,然后取出PCR管，放入PCR儀中。7.3.1.4進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min;94℃變性30s,58℃退火30s,72℃延伸30s,共進(jìn)行35次循環(huán)，72℃延伸7min。(可根據(jù)儀器和試劑要求對反應(yīng)參數(shù)作適當(dāng)調(diào)整。)7.3.1.5反應(yīng)結(jié)束后取出PCR管，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。7.3.2對照PCR擴(kuò)增7.3.2.1在試樣PCR擴(kuò)增的同時，應(yīng)設(shè)置陰性對照、陽性對照和空白對照。7.3.2.3除模板外，其余組分與PCR擴(kuò)增與7.2.1相同。瓊脂糖溶液中加入5μLEB溶液，混勻，稍適冷卻后，將其倒入電泳板上，插上梳板，室溫下凝固合成凝膠后，放入1×TAE緩沖液中，垂直向上輕輕拔去梳板。取12μLPCR產(chǎn)物與3μL加樣緩沖液混合后加入凝膠點(diǎn)樣孔，同時在其中一個點(diǎn)樣空中加入DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，接通電源在2V/cm~5V/泳檢測。47.6PCR產(chǎn)物回收7.7PCR產(chǎn)物測序驗(yàn)證8.1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果——PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果陰性者判為不含綠5DB12/T843—201861GACAAGGAAGCAAAGTAGCAATGATATAAAATGTTCAGA181CTCATACTAGCTCCCCAATTTGTTT241AATTCAATTCTAGATTGTAAGCACTTAAAAAATCAAGAATCTAAGAAAACAAAT301ATGCAACCTCAACTGAAGGTAGTACAAACAGGATTGAGAAAAAGAGAG注：劃線部分為Mungbean_470bp_F和Mungbean_