酶聯(lián)免疫吸附試驗-ELISA

酶聯(lián)免疫吸附試驗ELISAELISA實(shí)驗原理酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linkedimmunosorbentassay簡稱ELISA

）：一種固相酶免疫測定技術(shù)。實(shí)驗原理：以待測抗原（或抗體）與酶標(biāo)抗體（或抗原）的特異結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過酶活力測定來確定抗原（或抗體）含量。結(jié)合了免疫反應(yīng)和酶催化反應(yīng)，是一種特異而又敏感的技術(shù)。先將已知抗原或抗體包被于固相載體的表面，與待檢樣品中的相應(yīng)抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)，再加入酶標(biāo)記抗體或抗原與免疫復(fù)合物結(jié)合，最后加入酶的作用底物，根據(jù)產(chǎn)物顏色的深淺測定其A值，可進(jìn)行定性或定量分析。ELSA試驗主要技術(shù)類型有間接法、雙抗夾心法、競爭法等。間接法用于測定抗體。

原理是：將已知抗原連接在固相載體上，待測抗體與抗原結(jié)合后再與酶標(biāo)二抗結(jié)合，形成抗原-待測抗體-酶標(biāo)二抗的復(fù)合物，復(fù)合物的形成量與待測抗體量成正比。

抗原第1抗體酶第2抗體待檢抗體底物有色產(chǎn)物酶標(biāo)儀檢測技術(shù)原理：雙抗夾心法用于檢測抗原。利用待測抗原上的兩個抗原決定簇A和B分別與固相載體上的抗體A和酶標(biāo)抗體B結(jié)合，形成抗體A-待測抗原-酶標(biāo)抗體B復(fù)合物，復(fù)合物的形成量與待測抗原含量成正比，屬非競爭性反應(yīng)類型。競爭法用酶標(biāo)抗原（抗體）與待測的非標(biāo)記抗原（抗體）競爭性的與固相載體上的抗體（抗原）結(jié)合，待測抗原（抗體）多，則形成非標(biāo)記復(fù)合物多，酶標(biāo)抗原與抗體結(jié)合就少，也就是酶標(biāo)記復(fù)合物少，因此，顯色程度與待測物含量成反比。既可用于抗原又可用于抗體檢測。（間接法）實(shí)驗步驟1.包被抗原：用包被液將抗原作適當(dāng)稀釋,每孔加100微升，4℃冰箱放置16～18小時。2.洗滌：倒盡板孔中液體，加200微升洗滌液，靜放三分鐘，反復(fù)三次，最后將反應(yīng)板倒置在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡。3.加封閉液200微升，37℃放置一小時。4.洗滌同2。5.加待檢血清：用稀釋液將被檢血清作幾種稀釋,每孔100微升。37℃放置1小時。6.洗滌同2。7.加二抗（酶標(biāo)抗體）,每孔100微升,放置37℃1小時。8.洗滌同2。9.加底物：鄰苯二胺溶液加100微升，室溫暗處10--20分鐘。10.加終止液：每孔加50微升H2SO4。11.觀察結(jié)果：在20分鐘內(nèi)，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔OD值，測定波長490nm。實(shí)驗結(jié)果P/N值=（待檢標(biāo)本孔吸收值-空白孔平均吸收值）/（陰性標(biāo)本孔的平均吸收值-空白孔的平均吸收值）=標(biāo)本孔A值/陰性對照孔A值例：12345678910

空空陰陰待待待待待待P/N=(6個待檢孔的平均吸光值-1、2孔的平均值）/（3、4孔的平均值-1、2孔的平均值）注意事項每個待檢樣品平行加兩份，以保證實(shí)驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。嚴(yán)格控制抗原與抗體、抗體與酶標(biāo)抗體反應(yīng)時間。太短，敏感性下降；太長，吸附的抗原或復(fù)合物可能脫落。洗板時，洗液應(yīng)注滿各孔，所用的吸水紙勿重復(fù)使用顯色液現(xiàn)配現(xiàn)用，A液與B液不接觸金屬器械。操作過程中