DB45T-水牛胚胎分割技術(shù)操作規(guī)程編制說明

廣西地方標(biāo)準(zhǔn)《水牛胚胎分割技術(shù)操作規(guī)程》（征求意見稿）編制說明一、任務(wù)來源、起草單位、主要起草人根據(jù)《廣西壯族自治區(qū)市場監(jiān)督管理局關(guān)于下達(dá)2023年廣西地方標(biāo)準(zhǔn)制修訂項目計劃的通知》（桂市監(jiān)函（2023）2257號)文件精神，由廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出，廣西壯族自治區(qū)水牛研究所起草的廣西地方標(biāo)準(zhǔn)《水牛胚胎分割技術(shù)操作規(guī)程》（項目編號：2023-1204）已獲批立項。為高質(zhì)量編制廣西地方標(biāo)準(zhǔn)《水牛胚胎分割技術(shù)操作規(guī)程》，由起草單位成立標(biāo)準(zhǔn)編制工作組并進(jìn)行如下分工：姓名職稱/職位工作單位主要負(fù)責(zé)工作鄭海英高級畜牧師廣西壯族自治區(qū)水牛研究所統(tǒng)籌標(biāo)準(zhǔn)編制工作，組織人員進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布后的宣貫培訓(xùn)。負(fù)責(zé)起草標(biāo)準(zhǔn)草案、征求意見稿和標(biāo)準(zhǔn)編制說明、送審稿及編制說明的編寫工作及征求意見會、網(wǎng)上征求意見的匯總修改。尚江華研究員廣西壯族自治區(qū)水牛研究所負(fù)責(zé)起草標(biāo)準(zhǔn)草案、征求意見稿和標(biāo)準(zhǔn)編制說明、送審稿及編制說明的編寫工作及征求意見會、網(wǎng)上征求意見的匯總修改。楊春艷正高級畜牧師廣西壯族自治區(qū)水牛研究所負(fù)責(zé)起草標(biāo)準(zhǔn)草案、征求意見稿和標(biāo)準(zhǔn)編制說明、送審稿及編制說明的編寫工作及征求意見會、網(wǎng)上征求意見的匯總修改。黃加祥正高級畜牧師廣西壯族自治區(qū)水牛研究所負(fù)責(zé)起草標(biāo)準(zhǔn)草案、征求意見稿和標(biāo)準(zhǔn)編制說明、送審稿及編制說明的編寫工作及征求意見會、網(wǎng)上征求意見的匯總修改。鄭威高級畜牧師廣西壯族自治區(qū)水牛研究所負(fù)責(zé)起草標(biāo)準(zhǔn)草案、征求意見稿和標(biāo)準(zhǔn)編制說明、送審稿及編制說明的編寫工作及征求意見會、網(wǎng)上征求意見的匯總修改。羅華技術(shù)主管皇氏賽爾生物科技（廣西）有限公司負(fù)責(zé)起草標(biāo)準(zhǔn)草案、征求意見稿和標(biāo)準(zhǔn)編制說明、送審稿及編制說明的編寫工作及征求意見會、網(wǎng)上征求意見的匯總修改。二、制定標(biāo)準(zhǔn)的必要性和意義廣西絕大多數(shù)水牛屬沼澤型，長期以來都是作為役用家畜在農(nóng)村分散飼養(yǎng)，乳用性能較低。隨著農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和我區(qū)奶業(yè)發(fā)展的需要，優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)是我區(qū)水牛奶業(yè)發(fā)展方向，本地水牛向乳用水牛方向轉(zhuǎn)變成為必然。目前廣西現(xiàn)有存欄水牛225萬頭，水奶牛僅6.96萬頭，能繁母奶水牛為4.09萬頭，存在逐年下降的一個趨勢，通過簡單的動物本交等生產(chǎn)方式早已經(jīng)不能快速提高優(yōu)質(zhì)奶水牛的數(shù)量和群體規(guī)模。當(dāng)前我國水牛奶業(yè)存在良種種源匱乏的瓶頸，要突破這一瓶頸，必須集成現(xiàn)代動物繁殖技術(shù)，迅速增加優(yōu)良奶水牛的數(shù)量，提高奶水牛群的質(zhì)量，而胚胎分割是解決這一問題的關(guān)鍵技術(shù)之一。2008年世界首例胚胎分割—性別鑒定試管水牛的誕生，證實了水牛胚胎分割在水牛良種繁育進(jìn)程中的可行性。水牛胚胎分割技術(shù)經(jīng)過近20年的發(fā)展，水牛胚胎分割后的存活率達(dá)到80％以上，胚胎分割的半胚產(chǎn)犢率超過60％，與在牛和水牛體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)后代的效率在10％左右相比，有更大的成功率和更高的效率，胚胎分割在理論和技術(shù)方法上都已經(jīng)相當(dāng)完善。胚胎分割技術(shù)的推廣應(yīng)用，可以帶動水牛其他胚胎生物技術(shù)的快速發(fā)展應(yīng)用，胚胎分割結(jié)合活體采卵-體外受精、胚胎冷凍及胚胎移植技術(shù)，有利于水牛胚胎生產(chǎn)的工廠化，迅速增加優(yōu)良水牛的數(shù)量。胚胎分割結(jié)合性別控制技術(shù)，將比無性別控制繁育優(yōu)良水牛的數(shù)量和速度增加近一倍，從而可以節(jié)省近一半的時間、精力和費(fèi)用，這將有利于加快良種水牛種源的擴(kuò)繁，提高水牛的選擇強(qiáng)度，加快水牛品種改良步伐和奶業(yè)產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程，促進(jìn)優(yōu)質(zhì)高效畜牧業(yè)的發(fā)展。通過制定廣西地方標(biāo)準(zhǔn)《水牛胚胎分割技術(shù)操作規(guī)程》，以標(biāo)準(zhǔn)為抓手，統(tǒng)一規(guī)定水牛胚胎分割實驗準(zhǔn)備、分割前胚胎的采集和評定、胚胎分割操作等技術(shù)要求，對提高廣西水牛胚胎分割操作技術(shù)水平，從源頭上提高廣西優(yōu)質(zhì)水牛的數(shù)量，推動廣西水牛產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展，助力鄉(xiāng)村振興具有重要意義。三、主要起草過程（一）成立標(biāo)準(zhǔn)編制工作組廣西地方標(biāo)準(zhǔn)《水牛胚胎分割技術(shù)操作規(guī)程》項目任務(wù)下達(dá)后，廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳成立了標(biāo)準(zhǔn)編制工作組，起草單位制定了起草編寫方案與進(jìn)度安排，明確任務(wù)職責(zé)，確定工作技術(shù)路線，開展標(biāo)準(zhǔn)研制工作。具體標(biāo)準(zhǔn)編制工作由廣西壯族自治區(qū)水牛研究所相關(guān)技術(shù)人員組成標(biāo)準(zhǔn)編制工作組完成。編制工作組下設(shè)二個組分別是資料收集組、草案編寫組資料收集組負(fù)責(zé)國內(nèi)外有關(guān)水牛胚胎分割技術(shù)操作的文獻(xiàn)資料的查詢、收集和整理工作，查閱前人對水牛胚胎分割技術(shù)操作的有關(guān)研究情況和目前科學(xué)界水牛胚胎分割技術(shù)操作的研究進(jìn)展。草案編寫組負(fù)責(zé)起草標(biāo)準(zhǔn)草案及后續(xù)征求意見稿和標(biāo)準(zhǔn)編制說明、送審稿及編制說明等編寫工作，包括后期召開征求意見會、網(wǎng)上征求意見，以及標(biāo)準(zhǔn)的不斷修改和完善。（二）收集整理文獻(xiàn)資料標(biāo)準(zhǔn)編制工作組收集了國內(nèi)“水牛胚胎、胚胎分割、胚胎分割技術(shù)”相關(guān)資料。主要有：GB/T25881-2010《牛胚胎》GB/T26938-2011《牛胚胎生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程》NY/T1445-2007《奶牛胚胎移植技術(shù)規(guī)程》NY/T1674-2008《牛羊胚胎質(zhì)量檢測技術(shù)規(guī)程》NY/T1572-2007《牛胚胎移植技術(shù)規(guī)程》DB45/T1951-2019《水牛胚胎冷凍保存技術(shù)操作規(guī)程》DB64/T1785-2021《奶牛性控胚胎移植技術(shù)規(guī)程》DB21/T3493-2021《牛體外受精胚胎生產(chǎn)及非手術(shù)法移植技術(shù)操作規(guī)程》（三）研討確定標(biāo)準(zhǔn)主體內(nèi)容標(biāo)準(zhǔn)編制工作組在對收集的資料進(jìn)行整理研究之后，標(biāo)準(zhǔn)編制工作組召開了標(biāo)準(zhǔn)編制會議，對標(biāo)準(zhǔn)的整體框架結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，并對標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)鍵性內(nèi)容進(jìn)行了初步探討。經(jīng)過研究，標(biāo)準(zhǔn)的主體內(nèi)容確定為術(shù)語和定義、試劑、耗材、設(shè)備、工作液的配方及配制和實驗室要求、分割前胚胎的采集和評定、分割前的準(zhǔn)備、胚胎分割操作、半胚培養(yǎng)、半胚發(fā)育能力判定。（四）調(diào)研、形成草案、征求意見稿2023年5月～7月，標(biāo)準(zhǔn)起草工作小組進(jìn)行了廣泛實地調(diào)研工作，查閱了大量的國內(nèi)外文獻(xiàn)資料，對水牛胚胎分割技術(shù)的前人研究成果進(jìn)行系統(tǒng)總結(jié)。調(diào)研的同時召集廣西壯族自治區(qū)水牛研究所、廣西皇氏賽爾生物技術(shù)有限公司等單位開展了標(biāo)準(zhǔn)研討會，對水牛胚胎分割技術(shù)的有關(guān)研究情況和目前科學(xué)界水牛胚胎分割技術(shù)進(jìn)行系統(tǒng)總結(jié)。形成了標(biāo)準(zhǔn)的基本構(gòu)架，對主要內(nèi)容進(jìn)行了討論并對項目的工作進(jìn)行了部署和安排。2023年8月～9月，在前期工作的基礎(chǔ)之上，通過理清邏輯脈絡(luò)，整合已有的參考資料中有關(guān)水牛胚胎分割技術(shù)的部分，在廣西區(qū)內(nèi)相關(guān)單位、企業(yè)等進(jìn)行廣泛實地調(diào)研及查閱資料的基礎(chǔ)上，按照簡化、統(tǒng)一等原則編制完成廣西地方標(biāo)準(zhǔn)《水牛胚胎分割技術(shù)操作規(guī)程》（草案），并提出申請立項。2023年8月22日，根據(jù)《廣西壯族自治區(qū)市場監(jiān)督管理局關(guān)于下達(dá)2023年廣西地方標(biāo)準(zhǔn)制修定項目計劃的通知》廣西地方標(biāo)準(zhǔn)《水牛胚胎分割技術(shù)操作規(guī)程》獲批立項。2023年10月～11月，標(biāo)準(zhǔn)起草工作組再次深入廣西區(qū)內(nèi)各相關(guān)單位、企業(yè)進(jìn)行實地調(diào)研。通過實地調(diào)研，掌握各相關(guān)單位關(guān)于水牛胚胎分割技術(shù)的具體技術(shù)要求。以草案為基礎(chǔ)，提煉核心技術(shù)細(xì)節(jié)，在廣西內(nèi)廣泛開展技術(shù)對比和總結(jié)，并實際征求意見，通過收集反饋了大量意見，標(biāo)準(zhǔn)編制工作組多次召開會議，對標(biāo)準(zhǔn)草案進(jìn)行了反復(fù)修改和研究討論。進(jìn)一步討論完善標(biāo)準(zhǔn)草案，形成廣西地方標(biāo)準(zhǔn)《水牛胚胎分割技術(shù)操作規(guī)程》（征求意見稿）和（征求意見稿）編制說明。四、制定標(biāo)準(zhǔn)的原則和依據(jù)，與現(xiàn)行法律、法規(guī)的關(guān)系，與有關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的協(xié)調(diào)情況（一）編制原則1、實用性原則本文件是在充分收集當(dāng)前國內(nèi)、外最新的研究資料，結(jié)合起草單位多年積攢的實踐經(jīng)驗和實驗數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上而總結(jié)起草的，針對水牛胚胎分割技術(shù)規(guī)定明確的、詳細(xì)的操作內(nèi)容和步驟，對生產(chǎn)上進(jìn)行水牛胚胎分割操作的人員起到很好的標(biāo)桿和指導(dǎo)作用，有利于胚胎分割技術(shù)的推廣應(yīng)用于生產(chǎn)中，具有較強(qiáng)的實用性和可操作性。2、協(xié)調(diào)性原則本文件編寫過程中注意了與水牛胚胎分割技術(shù)相關(guān)法律法規(guī)的協(xié)調(diào)問題，在內(nèi)容上與現(xiàn)行法律法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)協(xié)調(diào)一致。3、規(guī)范性原則本文件嚴(yán)格按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》編寫本標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容，保證標(biāo)準(zhǔn)的編寫質(zhì)量。4、前瞻性原則本文件在兼顧當(dāng)前廣西水牛胚胎分割技術(shù)操作現(xiàn)實情況的同時，還考慮到了研究機(jī)構(gòu)水牛胚胎分割技術(shù)操作需求快速發(fā)展的趨勢和產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整需要，在標(biāo)準(zhǔn)中體現(xiàn)了個別特色性、前瞻性和先進(jìn)性條款，作為對水牛胚胎分割技術(shù)操作發(fā)展的指導(dǎo)。（二）編制依據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)則起草，標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容參考相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)文件并結(jié)合起草單位多年的實踐經(jīng)驗和實驗數(shù)據(jù)總結(jié)進(jìn)行起草。（三）與現(xiàn)行法律、法規(guī)的關(guān)系，與有關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的協(xié)調(diào)情況本編制工作組承諾本標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容與各項指標(biāo)不違反相關(guān)法律法規(guī)要求，且不低于國家強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)。推薦性國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求。經(jīng)查詢，目前國內(nèi)沒有相同或相似的國家標(biāo)準(zhǔn)，地方標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。水牛胚胎分割技術(shù)操作流程已經(jīng)相當(dāng)成熟完善，但目前沒有查詢到關(guān)于水牛胚胎分割技術(shù)相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)的制定有利于胚胎分割技術(shù)的推廣應(yīng)用于生產(chǎn)中。主要條款的說明廣西地方標(biāo)準(zhǔn)《水牛胚胎分割技術(shù)操作規(guī)程》主要內(nèi)容包括術(shù)語和定義、試劑、耗材、設(shè)備、工作液的配方及配制和實驗室要求、分割前胚胎的采集和評定、分割前的準(zhǔn)備、胚胎分割操作、半胚培養(yǎng)、半胚發(fā)育能力判定。（一）術(shù)語和定義胚胎分割的術(shù)語和定義是根據(jù)胚胎分割技術(shù)所使用的操作方法及作用做出定義。胚胎分割是借助顯微操作技術(shù)或徒手操作方法切割早期胚胎成二、四等多等份，再移植給受體母畜，從而獲得同卵雙胎或多胎的生物學(xué)新技術(shù)。體內(nèi)胚胎和體外受精的術(shù)語和定義是參考DB45/T1951-2019《水牛胚胎冷凍保存技術(shù)操作規(guī)程》的3.2和3.4進(jìn)行定義，如圖1。圖1源自DB45/T1951-2019《水牛胚胎冷凍保存技術(shù)操作規(guī)程》胚胎解凍的術(shù)語和定義是參照DB45/T1682《水牛胚胎質(zhì)量檢測技術(shù)規(guī)程》的3.2進(jìn)行定義，如圖2。圖2源自DB45/T1682《水牛胚胎質(zhì)量檢測技術(shù)規(guī)程》（二）試劑、耗材、設(shè)備、工作液的配方及配制和實驗室要求水牛胚胎分割所用是試劑、耗材、設(shè)備、工作液的配方均是依據(jù)起草單位多年的經(jīng)驗并結(jié)合胚胎分割實驗實際操作總結(jié)匯總確定的。實驗室要求則是參照DB45/T1951-2019《水牛胚胎冷凍保存技術(shù)操作規(guī)程》的4.4提出相關(guān)規(guī)定，如圖3。圖3源自DB45/T1951-2019《水牛胚胎冷凍保存技術(shù)操作規(guī)程》（三）分割前胚胎的采集和評定1.胚胎的采集水牛的胚胎采集可分為體內(nèi)胚胎、體外受精胚胎和冷凍胚胎三個部分，而胚胎在不同發(fā)育時期對分割效果也有著一定的影響，因此，起草單位也進(jìn)行了胚胎不同發(fā)育時期對分割效果的影響研究，結(jié)果如表1所示。表1.不同的發(fā)育時期對分割效果的影響胚胎發(fā)育階段胚胎數(shù)重復(fù)分割成功率（％）囊胚發(fā)育率（％）囊胚細(xì)胞數(shù)桑椹胚711072.96±8.18b58.31±4.90c52.1±8.1a早期囊胚391084.17±7.54a74.99±12.74b56.7±13.0a擴(kuò)展囊胚511076.06±6.21b68.83±9.56bc54.9±6.5a對照3010—94.17±12.45a118.5±4.9b從表1結(jié)果看出，比較桑椹胚、早期囊胚和擴(kuò)展囊胚的分割，早期囊胚的分割成功率顯著高于其他兩組（84.17％VS72.96％、76.06％）（P＜0.05）。其半胚發(fā)育率也顯著高于桑椹胚組（74.99％VS58.31％）（P＜0.05），也稍高于擴(kuò)展囊胚組的（74.99％VS68.83％）（P＞0.05）。而三者的囊胚細(xì)胞數(shù)差異不顯著（P＞0.05）。各處理組的半胚的囊胚發(fā)育率（58.31％、74.99％、68.83％VS94.17％）及囊胚細(xì)胞數(shù)都顯著低于對照組的（P＜0.01）。說明水牛早期囊胚更適宜分割。因此，根據(jù)起草單位多年的經(jīng)驗并結(jié)合實驗驗證，確定體內(nèi)胚胎宜借助體視顯微鏡挑選從母畜的輸卵管或子宮角內(nèi)回收發(fā)育到受精后第5d的水牛桑椹胚和發(fā)育到受精后第6d～8d的囊胚用于分割。體外受精胚胎是由卵巢或活體采卵獲取的水牛卵母細(xì)胞，經(jīng)體外成熟、體外授精及早期胚胎的體外培養(yǎng)的，需采集在受精后的第5d～8d（受精當(dāng)天計為0d），借助體視顯微鏡挑選受精后第5d形成的桑椹胚和受精后第6d～8d形成的囊胚備分割；冷凍胚胎的采集則先需對冷凍胚胎進(jìn)行解凍，具體操作方法參照DB45/T1951-2019《水牛胚胎冷凍保存技術(shù)操作規(guī)程》中的9.2.2進(jìn)行，如圖4。使用胚胎培養(yǎng)液清洗3次后，轉(zhuǎn)入顆粒細(xì)胞單層微滴內(nèi)培養(yǎng)復(fù)蘇，重新形成囊胚腔為存活的胚胎后方可進(jìn)行分割使用。圖4源自DB45/T1951-2019《水牛胚胎冷凍保存技術(shù)操作規(guī)程》2.胚胎發(fā)育階段和質(zhì)量等級評定胚胎發(fā)育階段劃分和胚胎分級評定參照DB45/T1682《水牛胚胎質(zhì)量檢測技術(shù)規(guī)程》的規(guī)定進(jìn)行。分割前胚胎的質(zhì)量應(yīng)達(dá)到B級（含B級）以上，即胚胎的發(fā)育階段與預(yù)期的發(fā)育階段基本一致。胚胎形態(tài)較完整，輪廓清晰，色調(diào)及細(xì)胞密度良好，透明帶光滑完整,厚度適中，存在一定數(shù)量大小和形狀不規(guī)則的細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)，有一定數(shù)量細(xì)胞的顏色明暗不一、密度不均勻，變性細(xì)胞比例為10％~20％。（四）分割前準(zhǔn)備水牛胚胎分割主要分為顯微分割和徒手分割兩種方法，進(jìn)行顯微分割前需檢查和調(diào)整顯微操作裝置，將玻璃針細(xì)度為10μm或金屬分割刀及外徑約為120μm的固定吸管安裝于顯微操作儀上；進(jìn)行徒手分割前應(yīng)檢查和調(diào)試好體視顯微鏡，將金屬分割刀提前用高壓滅菌鍋高溫121℃消毒20min，檢查和調(diào)試好體視顯微鏡，然后將已滅菌的金屬分割刀放入100mm的無菌塑料平皿中備用。此外，還需要制備好分割液滴。分割液滴是用來在胚胎分割過程中提供養(yǎng)分和環(huán)境支持的特殊液體，其組成可以影響胚胎分割的成功率和發(fā)育結(jié)果。選擇合適的分割液滴可以有助于提高成功率和胚胎品質(zhì)。因此，起草單位也進(jìn)行了不同切割液對桑椹胚和囊胚分割效果的影響研究，根據(jù)分割液和胚胎發(fā)育階段，將分割后成對半胚分組分別進(jìn)行體外培養(yǎng)。從表2結(jié)果可以看出，在PBS+0.2MS與PBS+5％PVP中分割桑椹胚，其分割成功率顯著高于PBS（71.67％、67.26％VS55.44％）（P＜0.05），而半胚的囊胚發(fā)育率及囊胚細(xì)胞數(shù)三者均無差異顯著性（P＞0.05）；在PBS+0.2MS與PBS+5％PVP中分割囊胚，其分割成功率顯著高于PBS（79.13％、76.73％VS65.25％）（P＜0.05），而半胚培養(yǎng)的囊胚發(fā)育率及囊胚細(xì)胞數(shù)三者差異均無顯著性(P＞0.05)；由此說明，在PBS中分別添加0.2M的蔗糖和5％的PVP有利于提高水牛桑椹胚和囊胚的分割成功率。表2.不同切割液對桑椹胚和囊胚分割效果的影響胚胎時期分割液胚胎數(shù)重復(fù)分割成功率（％）囊胚發(fā)育率（％）囊胚細(xì)胞桑椹胚PBS621055.44±9.04c51.73±13.00b52.1±8.1aPBS+0.2MS661071.67±10.98ab58.31±12.29ab49.2±6.1aPBS+5％PVP701067.26±12.81b55.00±11.69ab52.9±6.5a囊胚PBS591065.25±10.70b64.08±15.51ab54.9±7.5aPBS+0.2MS551079.13±10.01a67.67±14.89a56.6±6.9aPBS+5％PVP671076.73±11.73a65.25±12.18a55.9±7.0a因此，依據(jù)起草單位多年的經(jīng)驗以及實驗驗證，胚胎分割液宜在PBS中分別添加0.2M的蔗糖和5％的PVP，并將配制好的分割液從4℃冰箱取出，在直徑為100mm的無菌塑料平皿中制作6～8個100μL大小的分割液滴，做好標(biāo)記后，在液滴上覆蓋石蠟油，以石蠟油沒過液滴為宜。再將已制備分割液的平皿放培養(yǎng)箱中孵育平衡15～30min，得到胚胎分割液滴。（五）胚胎分割操作起草單位通過近十年來的課題項目深入研究，解決了水牛桑椹胚分割前的去致密化處理方法和時長，篩選出分割液的最佳濃度和分割方法以及最適合分割的胚胎發(fā)育狀態(tài)，并且在此基礎(chǔ)上，已針對徒手分割新鮮胚胎和冷凍胚胎的各個環(huán)節(jié)及其對胚胎分割效果的影響及取樣胚冷凍的可行性等進(jìn)行了大量研究工作，攻克了水牛胚胎分割的技術(shù)難點，建立了水牛胚胎分割穩(wěn)定高效的一套操作程序。首先是探索了去致密化處理對水牛桑椹胚分割效果的影響。從表3可以看出，水牛桑椹胚經(jīng)去致密化處理分割，其分割成功率(68.0％VS50.6％)和囊胚發(fā)育率(57.9％VS41.0％)均顯著高于未處理組(P＜0.01)，囊胚細(xì)胞數(shù)差異不顯著(52.1±8.1，52.9±6.5)(P＞0.05)。說明桑椹胚去致密化有利于分割。表3.去致密化處理對桑椹胚分割效果的影響處理組胚胎數(shù)分割成功數(shù)(％)囊胚發(fā)育數(shù)(％)囊胚細(xì)胞數(shù)去致密化89121(68.0)a70(57.9)a52.1±8.1a未去致密化7778(50.6)b32(41.0)b52.9±6.5a其次，探索了不同分割方法對水牛桑椹胚和囊胚分割效果的影響。如表4所示，用顯微分割法和徒手分割法分別分割桑椹胚和囊胚，其分割成功率(70.76％VS71.49％)(79.02％VS80.77％)、囊胚發(fā)育率(57.27％VS57.60)(67.26％VS68.94％)和囊胚細(xì)胞數(shù)三者均無顯著差異性（P＞0.05）。圖1和圖2則是顯微分割法和徒手分割法分割胚胎時的圖片以及分割后的半胚效果，說明兩種分割方法均可用于水牛桑椹胚和囊胚的分割。表4.不同分割方法對桑椹胚和囊胚分割效果的影響胚胎時期分割方法胚胎數(shù)重復(fù)分割成功率％囊胚發(fā)育率％囊胚細(xì)胞數(shù)桑椹胚顯微分割法581070.76±7.36b57.27±5.90b52.9±6.5a徒手分割法631071.49±6.64b57.60±5.70b54.9±7.5a囊胚顯微分割法651079.02±6.39a67.26±10.69a52.1±8.1a徒手分割法541080.77±7.90a68.94±4.93a51.7±9.0a圖1.顯微分割法分割胚胎（左）和徒手分割法分割胚胎（右）圖2.分割囊胚的半胚（左）；分割桑椹胚的半胚（中）；胚胎分割-性別鑒定試管水牛犢（右）顯微分割和徒手分割桑椹胚和囊胚的分割操作也是根據(jù)起草單位多年的經(jīng)驗進(jìn)行總結(jié)而來。用顯微分割法對桑椹胚進(jìn)行分割的操作為：胚胎用分割液洗2～3次后，移入不含Ca2+、Mg2+的PBS液中預(yù)處理20min去致密化。然后將胚胎單獨放入分割液滴，置于倒置顯微鏡（200倍）下，用顯微固定吸管固定住胚胎，從吸附點對面用顯微分割刀逐漸由上向下切割胚胎，將桑椹胚一分為二；對囊胚的分割操作為：胚胎用分割液洗2～3次后，將胚胎單獨放入分割液滴，置于倒置顯微鏡（200倍）下，用顯微固定吸管固定住胚胎，從吸附點對面用顯微分割刀逐漸由上向下切割囊胚，將囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)一分為二。用徒手分割法對桑椹胚進(jìn)行分割的操作為：用分割液洗滌胚胎2～3次，移入不含Ca2+、Mg2+的PBS液中預(yù)處理20min去致密化；將胚胎移入分割液滴中，每個液滴放入1枚胚胎；借助體視顯微鏡，先在分割液滴的底部用分割刀輕輕劃2條直線以固定住胚胎，然后用一只手固定塑料平皿在顯微鏡的視野下，用另一只手的拇指和食指夾住分割刀，中指頭做支架；將分割刀伸入液滴，將胚胎撥到劃痕上，再將分割刀移至胚胎正上方，并緩緩下移抵住胚胎，與下部的劃痕將胚胎固定；用分割刀壓住胚胎正中部垂直向