DB37T 4754.3-2024動物疫病鑒別檢測技術 第3部分：禽腺病毒Ⅰ群與禽腺病毒Ⅲ群

37Animaldiseaseidentificationanddetectiontechnology—Part3:GroupIadenovirusesandGroupIIIAvianad本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定動物疫病是影響山東省畜牧業(yè)健康發(fā)展的重要因素之一。不同病原或者相同病原的不同血清型/基動物疫病鑒別檢測技術標準的建立，規(guī)定了對不同病原、相同病原的不同血清型/基因型以及弱毒疫苗禽腺病毒（Avianadenovirus）分為3個屬：禽腺病毒屬（Aviadenovirus）、唾液腺病毒屬其中火雞出血性腸炎病毒主要危害火雞養(yǎng)殖；禽腺病毒Ⅲ群唯一成員減蛋綜合征病毒（Eggdrop于精準防控禽腺病毒感染具有重要意義。《動物疫病鑒別檢測技術》擬由三個部分技術的操作，便于檢測技術在禽腺病毒病臨床診斷、流行病學調查、檢驗檢疫等方面動物疫病鑒別檢測技術第3部分：禽腺病毒Ⅰ群與禽腺病毒Ⅲ群本文件描述了禽腺病毒Ⅰ群與Ⅲ群聚合酶鏈式反GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術規(guī)范PCR技術是在TaqDNA聚合酶作用下，以靶DNA為模板、靶DNA序列5'端與3'端互補的且長度一般為18bp～27bp的特異性寡核苷酸為引物、dNTP為反應原料，按照堿基配對及半保留復退火、延伸循環(huán)多次，DNA擴增產物呈指數型上升，并通過瓊脂凝膠電泳獲知擴增產物的分子量從而判定結果。本文件對禽腺病毒Ⅰ群與Ⅲ群靶基因進行PCR擴增，并通過特異性擴增產物分子量差異，用于5.4PCR反應試劑：10×TaqDNA聚合酶緩沖液、TaqDNA聚合酶（5U/μL）、dNTP（2.5mmol/L）；25.5磷酸鹽緩沖液（PBS）：0.01mol/L、pH7.4。5.60.5mol/LEDTA溶液：pH8.0。稱取EDTA18.61g，加滅菌水至80mL，用氫氧化鈉調pH至8.0，充分溶解，定容至100mL，室溫保10000×核酸熒光染料（GelRed/GelGreen），均勻鋪板，厚度為3mm～5mm。稱取EDTA4.4g、溴酚藍0.25g、二甲苯腈藍FF0.25g，依次溶于200mL滅菌水中，加入180mL甘5.11無核酸酶離心管（1.5mL）。5.12PCR檢測反應管（0.2mL）。6.4微型低速離心機：轉速≤6000r/min。比例混合，研磨成組織勻漿，裝入1.5mL無核酸酶離心管，置于高速冷凍離心機，4℃、12000r/min離心5min，取上清液提取核酸。8.2核酸提取10×TaqDNA聚合酶緩沖液2.5mMdNTPDNA樣品TaqDNA聚合酶0.5（2.5U）水將制備的陰性對照與待檢樣品DNA、陽性對照基因組DNA樣品溶液產物各2μL依次分別加入對應PCR取5μL擴增樣品，與1μL6×核酸電泳加樣緩沖液混勻（若使用含有染料的PCR預混液進行擴增，省略該環(huán)節(jié)），加樣至1.5%瓊脂糖凝膠樣品孔，置于電泳槽TAE緩沖液中，并設DL2000DNA分子標準電泳泳道，按照5V/cm設置電泳儀電壓，電泳30min。電泳結束后，置于凝膠成像儀拍攝圖9結果判定擴增產物經電泳檢測，質控標準同時滿足以下條件試驗有效，否9.2結果描述及判定檢樣品無特異性PCR產物，則判定為禽腺病毒I群、Ⅲ群核酸檢測陰性。電ATGTACGCYTCCGCCCTC20001000