藥品微生物檢驗及方法驗證

藥品微生物限度檢查及方法驗證從事藥品微生物限度檢查工作兩年時間，從學做到承擔工作到變得有點經驗，經歷了一個摸索、學習和積累的過程，回過頭來做一個總結，把一些零散的經驗和體會做一個梳理和歸整，以供在此崗位工作的同仁參考。第一部分：外圍工作外圍工作主要有器皿清洗、滅菌，培養(yǎng)基、試劑配制及滅菌，無菌室清潔消毒等。器皿的清洗是每個實驗室和每一個實驗員必須要做的最起碼的工作，工作要求簡單，操作方便，把握一個原則：干凈。培養(yǎng)基、試劑配制后一般都要求調PH到7.20，因為高溫滅菌之后PH值會下降0.2左右。固體培養(yǎng)基在滅菌前要先加熱煮沸，使瓊脂均勻分散。煮沸時要注意不要溢出容器，以免發(fā)生燙傷。萬一不小心溢出，可用一濕抹布蓋住容器口，迅速將其從加熱源上移開，不要在情急之下徒手去拿或者在容器側面拿，那樣容易被從容器口源源不斷溢出的培養(yǎng)基燙傷。液體物品滅菌后，不能立即打開放氣閥放氣，因為此時被滅菌物品的溫度大于100℃，在壓力等于常壓時，液體會暴沸，造成液體噴出或容器炸裂，發(fā)生事故萬級潔凈度的無菌室應當每周進行一次消毒，消毒劑每月更換一次，防止長期使用同一種消毒劑而使微生物形成耐藥性。消毒范圍包括墻壁，地面，天花板以及空氣。表面消毒可以用消毒劑擦拭，尤其注意門框邊緣以及出風回風口，不能留有死角；空氣消毒宜采用臭氧或者紫外燈。可以使用專門的臭氧發(fā)生器產生臭氧進行消毒，也可以在每一個操作間包括凈化臺安裝適宜功率的紫外燈，一方面紫外線可以對近距離的物體表面進行消毒，另一方面紫外線的作用也可以使空氣中的氧氣轉換成臭氧，從而能夠殺死空氣中的微生物。另外在每次做完實驗之后，都應當對實驗臺面以及地面進行消毒處理。第二部分：檢驗過程整個無菌室的檢驗操作過程應當有一個標準的操作規(guī)范，嚴格按照無菌操作的規(guī)定進行操作，包括進入無菌室的程序以及人員清潔消毒，都應當遵守標準來進行。首先，進入無菌室應當嚴格按照潔凈區(qū)（室）有關規(guī)定進行。進入之前先進行洗手消毒，在一更換鞋，脫去外衣，進入二更，穿潔凈工作服，注意穿戴潔凈工作衣帽時必須做到衣服的任何部位不得拖地。穿戴好后通過緩沖間進入無菌操作間。實驗前先對工作臺面進行消毒，然后再擺放實驗用品。實驗中供試液的制備是一個關鍵環(huán)節(jié)。針對不同的供試品性質制定不同的制備方法，原則上整個過程不得損傷供試品中污染的微生物，也不得污染供試品。在吸取供試液時，使用的吸管容量和最小刻度要和吸取的供試液量相匹配，不能使用10ml的吸管吸取1ml的供試液，以免造成誤差過大的情況，影響結果。吸取供試液時應當取均勻的液體注皿或者稀釋，取上清夜或沉淀物必然對結果產生影響，因為中藥口服制劑一般都含藥材原粉，不能溶解于稀釋液當中，只能以小顆粒分散在液體中，這些顆粒上邊會附著有一部分微生物，供試液的制備過程不能把附著在顆粒上的微生物全部洗脫到液體中，而且各種微生物細胞的沉降系數各不相同，在靜置狀態(tài)下，它們在液體中的分布也是不均勻的，所以必須取振搖均勻的供試液（混懸液）。在無菌操作的過程中，應當注意一些細節(jié)，特別是瓶口試管口以及鑷子剪刀等的灼燒滅菌和擦拭消毒。剪刀用消毒液擦拭消毒后必須烤干或者涼干再使用，避免剪刀上殘留的消毒液殺死供試品中的微生物。往平皿里加注供試液時，注意應當緩緩注入，速度過快容易造成液體飛濺，吸管壁殘留液體過多，導致污染操作臺面、器皿，培養(yǎng)皿中供試液量不足，影響結果。實驗中手臂不要有大的動作，不宜快速移動。凈化臺上物品的擺放應當有一定的順序，盡可能地減少來回交叉動作，因為這樣會導致層流凈化臺中氣流紊亂，容易引起污染也容易碰倒容器，發(fā)生意外。傾注培養(yǎng)基時，以培養(yǎng)基能夠覆蓋平皿底部為好，大概在15-20ml，不宜過多或過少。如過多則在搖勻時容易溢出皿外，過少則會營養(yǎng)不足，且在培養(yǎng)過程中容易干裂甚至不能覆蓋平皿底面，影響微生物生長。搖勻時應以平皿中供試液分布均勻即可，如果供試液顏色較淺不便于觀察，一般可以順逆時針交替搖20次左右即能達到均勻分布。從開始制備供試液到傾注培養(yǎng)基，時間不得超過1小時，否則供試液中的微生物有可能死亡或者繁殖。做完實驗后，關掉電源，工作臺面進行消毒，最好對房間地面也進行消毒。所有工作都進行完畢之后，將培養(yǎng)皿及實驗過程中使用到的、不宜在無菌室存放的器皿和試劑等通過傳遞窗傳遞到室外，將霉菌（酵母菌）、細菌、致病菌分別放入各自適宜的溫濕度環(huán)境培養(yǎng)。霉菌（酵母菌）一般置23~28℃培養(yǎng)48~72小時；細菌置30~35℃培養(yǎng)24~48小時；致病菌置第三部分：菌落計數及報告單填寫按照《中國藥典》2005年版規(guī)定，細菌以48小時菌落數字報告，霉菌（酵母菌）以72小時菌落數字報告，必要時延長至5~7天。菌落蔓延成片的平皿不宜計數，霉菌菌落為絲狀的集合體，在菌落較小時肉眼難以看清楚，因此培養(yǎng)時間一定要足，必要時可以延長培養(yǎng)時間。致病菌通常有大腸菌群和大腸埃希菌以及沙門菌，一般都需要進行增菌培養(yǎng)，增菌培養(yǎng)液不能作為鑒別致病菌檢出與否的依據，必須做進一步的分離培養(yǎng)和生化鑒別。的菌落從其形態(tài)上也很難做出區(qū)分，往往讓人覺得似是而非。針對上述幾種異常現(xiàn)象和可能的原因，經過實踐和參考相關的資料，提出解決辦法。首先，檢驗結果出現(xiàn)異常時，不論何種原因引起，從工作流程上來說，都必須安排另一名檢驗員進行復檢，以確保檢驗結果的準確性。分析原因只是為了在以后的工作當中進行改進，避免出現(xiàn)同類問題。其次，如果判斷是稀釋液、培養(yǎng)基和器皿滅菌不到位引起的污染，原則上培養(yǎng)基和稀釋液應當滅菌后棄去，重新配制，器皿可以重新清潔后再次滅菌，注意滅菌的時間和溫度等參數必須符合規(guī)定。如果判斷是供試品本身帶菌較多，在復檢時應當增加適當的稀釋級，但最低稀釋級的稀釋倍數不宜過大，否則會導致誤差太大而無法做出準確的結論。在復檢時應當注意吸取均勻的供試液進行注皿和稀釋，并在以后的每次實驗中都應當做到這一點，從而避免因供試液不均勻而引起的高稀釋級菌落數大于或接近于低稀釋級以及同一稀釋級各平皿菌落數相差過大的情況。第三，對于復檢仍出現(xiàn)高稀釋級菌落數大于或接近于低稀釋級的情況，可以判斷該產品有抑菌性，需要進行方法學驗證。實際上按照《中國藥典》2005年版的規(guī)定，每一個產品都應當進行衛(wèi)生學檢驗方法驗證，以確保針對該產品所采用的檢驗方法能夠消除供試品的抑菌性，從而確保檢驗結果的科學性和準確性。關于驗證，另外再述。第四，玫瑰紅鈉平皿上生長的難以鑒定是否為酵母菌的菌落，需要進一步做染色、鏡檢，以得出準確結論。另外，出現(xiàn)異常的檢驗結果，應當及時報知檢驗課課長。第六部分：衛(wèi)生學檢驗方法驗證當建立藥品的微生物限度檢查法時，應當對細菌、霉菌和酵母菌的計數方法和控制菌檢驗方法進行驗證；建立藥品的無菌檢查法時，應當對所建立的檢驗方法進行驗證。若藥品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變可能影響檢驗結果時，應當重新進行驗證。這項試驗的目的是驗證細菌、霉菌和酵母菌計數方法的準確性，驗證控制菌檢查方法和無菌檢查法的專屬性和可靠性，以保證檢驗結果的準確性、科學性以及檢驗方法的完整性。一、微生物限度檢查方法驗證包括計數方法與控制菌檢查法驗證。計數方法驗證：對細菌、霉菌和酵母菌計數方法進行驗證，有平板法和薄膜過濾法兩種方法，驗證要求對照菌回收率不得低于70%。控制菌檢查法驗證：是指建立對控制菌檢查方法的專屬性，因此要求陽性對照應檢出控制菌，陰性對照應無菌生長。試驗中使用的標準菌株有：大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌，白色念珠菌，黑曲霉。其中以大腸埃希菌代表革蘭氏陰性無芽孢桿菌，以金黃色葡萄球菌代表革蘭氏陽性球菌，枯草芽孢桿菌代表產芽孢菌，以白色念珠菌代表酵母菌，以黑曲霉代表霉菌。驗證試驗操作A、計數驗證方法操作要求1、菌種傳代不得超過5代，并采用適宜的方法保存。一般采用斜面保藏法保存于4℃的冰箱中。2、菌液濃度為50～100cfu/ml，要求進行活菌計數，即每次使用前進行培養(yǎng)計數。3、.驗證至少應進行3次獨立的平行試驗，并分別計算各菌每次試驗的回收率。B、計數法驗證操作計數法驗證時，可將試驗分為四個組（并可與控制菌檢查同時進行）。1、試驗組：平皿法計數時，取試驗可能用的最低稀釋級供試液1ml和50～100cfu/ml試驗菌，分別注入平皿，傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌制備2個平皿，按平皿法測定菌數。薄膜過濾法計數時，取規(guī)定量最低倍數稀釋供試液，過濾、沖洗，在最后一次沖洗液中加入50～100cfu/ml菌液，過濾，按薄膜法測定其菌數。2、菌液組：空白平皿中加入與試驗組等量的各標準菌株菌液。3、供試品對照組：取同試驗組的供試液1ml加入平皿中，測試供試品的本底菌。該組不加入對照菌液。4、稀釋劑對照組：若供試液制備需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾時，應增加稀釋劑對照組，以考察供試液制備過程中微生物受影響的程度。試驗時可以稀釋液代替供試品加入相應的菌液濃度，按試驗組方法計數。C、計數方法驗證結果判斷1、3次對照試驗中稀釋劑對照組的菌回收率分別均不低于70%。計數公式：稀釋劑對照組平皿菌落均數/菌液組平皿菌落均數×100%2、試驗組的菌回收率均不得低于70%。試驗組菌落均數-供試品對照組菌落均數計算公式：×100%菌液組菌落均數3、若試驗組菌回收率不低于70%，可按該供試液制備方法進行對供試品細菌、霉菌和酵母菌數的測定和計數。若試驗組菌回收率低于70%，應采用培養(yǎng)基稀釋法，離心沉淀法、薄膜過濾法或中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法，以消除供試品的抑菌活性，并重新驗證。D、計數驗證方法注意事項1、對照用菌液加入量為50~100cfu，加入體積可參照事前測得的菌液濃度，不可加入過多或過少，過多影響計數，過少則平行性較差，影響結果判斷。2、對照用菌液最好每次試驗前重新制備。每次使用前，都從低一稀釋級的菌液中吸取適宜的菌液進行稀釋，如果是兩次試驗間隔時間較長，則必須從原始培養(yǎng)液重新進行稀釋計數，或者重新接種培養(yǎng)，確保對照菌的活性和計數的準確性。3、大腸埃希菌為兼性厭氧菌，能夠利用蛋白胨作為營養(yǎng)，所以不宜用加有蛋白胨的稀釋液稀釋保存，而應使用0.9%的氯化鈉液。E、薄膜過濾計數驗證應注意事項。1、濾膜孔徑應不大于0.45μm，φ為50mm，濾膜可滅菌處理。2、濾膜材質不應受供試品及其溶劑的影響，使微生物能充分被截留。3、水溶性供試品，濾前用少量沖洗液潤濕濾膜，油性供試品、濾器與濾膜使用前應充分干燥。4、濾膜沖洗量100ml/次，不得少于3次，總量不宜過大，濾膜菌數不得超過100個/張。5、供試品含量1g或1ml/張，若含菌較多時，可稀釋至適宜的倍數過濾，但報告數必須乘以稀釋倍數。6、陰性對照按試驗條件加入稀釋液體，同法操作，不得有菌生長。F、控制菌驗證方法操作要求1、在建立藥品微生物限度檢查法時，應進行控制菌檢查方法的驗證，以確定所采用的方法適合于該藥品的控制菌檢查，若該藥品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變可能影響檢驗結果時，檢查方法應重新驗證。2、驗證時，按各品種項下微生物限度標準中規(guī)定檢查的控制菌選擇相應的驗證菌株。3、驗證大腸菌群檢查法時采用大腸埃希菌作為驗證菌株，驗證梭菌檢查法時，采用生孢梭菌作為驗證菌株。4、常用菌株選擇有代表性、普遍性、非致病性標準菌株為生孢梭菌，大腸埃希菌，乙型副傷寒沙門菌，金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌。5、菌株要求不得超過5代，采用適宜的方法保存。6、菌液制備：大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌用營養(yǎng)肉湯或營養(yǎng)瓊脂，生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物用硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，菌液濃度為10～100cfu/ml。H、控制菌驗證方法操作驗證分為兩組，即試驗組與陰性對照組。1、試驗組：取規(guī)定量供試液及10-100cfu試驗菌液，加入到增菌培養(yǎng)基中，按照相應的控制菌檢查法進行檢查，當采用薄膜過濾法時，取規(guī)定量供試液進行過濾、沖洗，在最后一次沖洗液中加入10-100cfu試驗菌液，過濾后注入培養(yǎng)基或取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。2、陰性對照組：陰性對照組是為了驗證該控制菌檢查方法的專屬性，具體操作同試驗組方法。驗證大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌的檢查方法時，采用金黃色葡萄球菌作為陰性對照菌，驗證銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、梭菌的檢查方法時，采用大腸埃希菌作為陰性對照菌，結果陰性對照菌不得檢出。I、控制菌檢查方法驗證結果判斷1、陰性對照組不得產生陽性反應。2、試驗組檢出試驗菌，可按該方法進行該控制菌檢查。3、若試驗組未檢出試驗菌應采用稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法或聯(lián)合使用上述方法以消除供試品的抑菌性，并重新驗證。4、驗證試驗可與控制菌檢查同時進行。驗證報告驗證報告的起草一般應當包括一下幾個項目：1、驗證產品的品種，批號；2、驗證試驗用培養(yǎng)基、稀釋液等的型號，來源，配制；3、標準菌株的名稱，代數與來源；4、供試液制備方法和過程；5、驗證試驗數據表；6、驗證結論。驗證試驗從平皿法開始，如果平皿法不能通過驗證，則依次改用培養(yǎng)基稀釋法，離心沉淀法，薄膜過濾法等。按照節(jié)省和經濟的原則，在滿足微生物生長條件（即消除抑菌性）的情況下，必須盡可能選擇實驗步