醫(yī)學(xué)C12-基因功能分析的基本策略

第十二章

基因功能分析的基本策略21世紀(jì)的研究熱點領(lǐng)域特定基因的功能研究對模式生物的研究基因敲除動物模型，轉(zhuǎn)基因動物模型，基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型，RNA干擾技術(shù)基因組功能預(yù)測用最大相似得同源基因的功能注釋咨詢序列用功能相關(guān)的保守序列模體進(jìn)行搜索用直系同源體簇中的已知基因注釋未知基因的功能

第一節(jié)利用轉(zhuǎn)基因模型研究基因的功能轉(zhuǎn)基因技術(shù)是指將外源基因?qū)胧芫鸭?xì)胞或胚胎干細(xì)胞中，通過外源基因與細(xì)胞染色體DNA間隨機(jī)重組的發(fā)生而將外源基因?qū)氲绞荏w染色體DNA中，并隨著細(xì)胞的分離而遺傳給后代，以這種方式可以制造轉(zhuǎn)基因動物模型細(xì)胞水平的轉(zhuǎn)基因一、利用轉(zhuǎn)基因動物分析特定基因在體內(nèi)的功能轉(zhuǎn)基因動物是指應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出的攜帶外源基因并能穩(wěn)定遺傳的動物，將外源基因整合到動物基因組上，被稱為轉(zhuǎn)基因特點分子及細(xì)胞水平操作，組織及動物整體水平表達(dá)轉(zhuǎn)基因動物的基本過程將改建后的外源基因用注射等方法導(dǎo)入試驗動物的受精卵或著床前胚胎干細(xì)胞將此受精卵（或著床前胚胎干細(xì)胞）植入受體動物的輸卵管（或子宮）中發(fā)育成攜帶有外源基因的轉(zhuǎn)基因動物基本方法顯微注射法胚胎干細(xì)胞法(embryonicstemcells,ES細(xì)胞)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法精子載體法轉(zhuǎn)基因動物中外源基因的檢測染色體及基因水平：斑點雜交、Southern雜交、PCR轉(zhuǎn)錄水平：Northern雜交蛋白質(zhì)水平：Western印跡轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用基因特異表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)基因的新功能發(fā)現(xiàn)新基因建立基因表達(dá)、調(diào)控的動物模型建立人類疾病的動物模型等導(dǎo)入貯藏蛋白基因的超級羊和超級小鼠導(dǎo)入人基因具特殊用途的豬和小鼠超級動物特殊動物轉(zhuǎn)基因動物在醫(yī)學(xué)及生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究特定基因在體內(nèi)組織中特異表達(dá)或表達(dá)時相研究基因在體內(nèi)的功能是增強(qiáng)某種功能還是導(dǎo)致某種疾病的發(fā)生發(fā)現(xiàn)基因的新功能或未知基因的功能發(fā)現(xiàn)新基因用于只在胚胎期才表達(dá)的基因結(jié)構(gòu)和功能的研究建立外源基因表達(dá)、調(diào)控的動物模型生產(chǎn)人體或動物進(jìn)行器官或組織移植時所需的器官和組織尚待解決的問題轉(zhuǎn)基因動物的成功率較低。目的基因在宿主染色體的整合及其特異性表達(dá)問題。插入突變，破壞宿主基因組功能

外源基因在宿主染色體上整合的拷貝數(shù)不等整合的外源基因遺傳丟失而導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因動物癥狀的不穩(wěn)定遺傳等產(chǎn)品純化問題。安全性問題。二、通過在細(xì)胞模型中表達(dá)特定基因以確定其功能基本程序特定基因的克隆將基因?qū)爰?xì)胞使之整合到細(xì)胞的染色體DNA中篩選高表達(dá)轉(zhuǎn)染基因的細(xì)胞第二節(jié)利用基因敲除模型研究基因的功能基因敲除指通過DNA同源重組定向地將外源基因插入宿主細(xì)胞染色體DNA，從而使特定基因在細(xì)胞內(nèi)或生物活體內(nèi)失活的過程基因敲除動物是指通過同源重組定向地在活體內(nèi)剔除特定基因地動物基因敲除小鼠是指特定基因在兩條染色體上的等位基因都喪失的小鼠過程：第一階段是在小鼠胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）水平剔除染色體上的一個等位基因

第二階段是在小鼠活體內(nèi)剔除另一個等位基因基因打靶的必備條件胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)能在體外培養(yǎng)，保留發(fā)育的全能性打靶載體（基因敲除載體）Neo（新霉素）陽性篩選標(biāo)志HSV-tk陰性篩選標(biāo)志：單純皰疹病毒(herpessimplexvirus)胸腺嘧啶激酶(thymidine

kinase)待剔除基因同源臂序列基因敲除的基本程序打靶載體的構(gòu)建打靶載體導(dǎo)入ES細(xì)胞：重組置換基因敲除ES細(xì)胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宮中嵌合體的雜交育種第三節(jié)通過抑制或沉默基因表達(dá)對基因的功能進(jìn)行分析研究在RNA水平上分析基因功能的方法有兩種反義RNA封閉mRNA的功能RNA干涉（RNAi)使基因處于沉默狀態(tài)利用反義RNA抑制基因表達(dá)水平反義RNA：指能與mRNA互補(bǔ)配對的RNA分子。5’5’3’3’轉(zhuǎn)錄5’3’mRNA正義鏈反義鏈反義RNA5’3’應(yīng)用：根據(jù)特定基因的序列設(shè)計反義RNA序列，然后通過構(gòu)建反義RNA轉(zhuǎn)錄載體建立轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型，并研究相應(yīng)基因表達(dá)產(chǎn)物的水平，推測基因功能是否受到干擾，也可以直接合成短的反義RNA并導(dǎo)入細(xì)胞中來研究基因的功能，如bcl-2基因的反義RNA治療B淋巴瘤和白血病反義RNA特點：能與mRNA互補(bǔ)配對，在空間上防礙以此mRNA為模板的蛋白質(zhì)合成，因而可在翻譯水平調(diào)控基因表達(dá)水平（負(fù)調(diào)控）利用RNAi技術(shù)在細(xì)胞中沉默特定基因以研究其功能RNAi技術(shù)是指由短雙鏈RNA誘導(dǎo)的同源mRNA的降解過程，可使基因的表達(dá)受到抑制RNAi的發(fā)現(xiàn)源于兩類研究，一類是轉(zhuǎn)基因植物的研究，另一類是反義RNA的研究雙鏈RNA之所以能引起特異性基因抑制，是由于其激活細(xì)胞內(nèi)的一種被稱為Dicer的酶復(fù)合物所致RNA干擾技術(shù)(1998)Nature391,806–811（核酸內(nèi)切酶和解旋酶）（RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物）（小干涉性RNA）利用RNAi技術(shù)研究特定基因功能的程序確定目標(biāo)RNA并選擇被干涉靶點避開蛋白質(zhì)結(jié)合部位選擇目標(biāo)RNA的AUG下游50～100bp區(qū)域的AA(N19)TT或AA(N21)序列，GC比在50％左右，長度在21-23nt，不超過30nt，與其他RNA序列沒有同源性準(zhǔn)備針對目標(biāo)RNA的siRNA用siRNA干涉目標(biāo)RNA合成siRNA

的方法化學(xué)合成法，價格昂貴體外轉(zhuǎn)錄法，價格便宜，但需避免RNA酶的污染體內(nèi)轉(zhuǎn)錄法合成短雙鏈發(fā)夾RNA，易操作siRNA

對目標(biāo)RNA的干擾siRNA

的轉(zhuǎn)染目標(biāo)RNA含量或蛋白質(zhì)表達(dá)水平的分析MicroRNA(miRNA)

是近幾年在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類具有調(diào)控功能的非編碼

RNA，它們主要參與基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。miRNA

的調(diào)控功能是十分重要的，近來發(fā)現(xiàn)它們在果蠅的細(xì)胞增殖、死亡及脂肪代謝，線蟲極性的形成，哺乳動物的造血干細(xì)胞的分化等過程中起了重要的調(diào)控作用。在植物中，miRNA

還參與了葉子與花的發(fā)育過程。miRNA

基因的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物

(pri-miRNA)

在細(xì)胞核中被RNase

Ⅲ

Drosha

切割成為前體

miRNA

(pre-miRNA)。胞質(zhì)中

pre-miRNA

在

Dicer

酶的作用下，被切割成雙鏈的

miRNA：miRNA*

配對分子，成熟的

miRNA

分子被解鏈，單鏈的miRNA進(jìn)入一個核糖蛋白復(fù)合體

miRNP

(也叫

RISC(RNA-induced

silencing

complex)

)miRNA

通過與靶基因的3'

UTR

區(qū)互補(bǔ)配對，指導(dǎo)

miRNP

復(fù)合體對靶基因

mRNA

進(jìn)行切割或者翻譯抑制

動物(尤其是人)

miRNA

的生物合成過程PrecursorofmiRNADicerantisense

miRNAmiRNPLi