傳代細胞培養(yǎng)實驗

傳代細胞培養(yǎng)實驗指導教師：費曉方2005年5月掌握無菌操作技術。了解傳代細胞的培養(yǎng)的一般方法與步驟。了解培養(yǎng)細胞的消化分散。了解細胞計數方法。了解培養(yǎng)液配制方法。了解倒置顯微鏡的使用。實驗目的和要求：為什么要學習細胞培養(yǎng)？實驗原理：細胞培養(yǎng)是將機體內的某組織取出，分散成單細胞，在人工條件下培養(yǎng)使其生存并不斷生長、繁殖的方法。借助這種方法可以觀察細胞的分裂繁殖、細胞的接觸抑制、以及細胞的衰老，死亡等生命現象。還可以利用培養(yǎng)細胞制備染色體，分析外界因素（如理化因素）對細胞的影響，研究細胞癌變等等。在細胞培養(yǎng)的基礎上發(fā)展了細胞融合、細胞雜交等細胞工程技術及單克隆抗體技術。動物細胞培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。直接從有機體獲取的細胞進行的培養(yǎng)是原代培養(yǎng)，若將培養(yǎng)細胞洗脫后轉移到另外的容器中進行在培養(yǎng)叫做傳代培養(yǎng)。目前，動物細胞培養(yǎng)技術已經達到一個新的階段：從不同分化組織衍生得到的許多類型的細胞能夠成功地在培養(yǎng)液中生長、反復傳代。在維持一個獨特細胞系長達數月的過程中，記錄下細胞的倍增次數和生長速率是很有用的，以便在合適的時間傳代以及在體外生活是中不同時間凍存細胞。實驗內容：*早期細胞培養(yǎng)，依靠的是精湛的操作技術和盡可能的靠近火焰一達到細胞的無菌化。*目前，超凈臺是使工作臺無菌化最經濟有效的手段。

（1）超凈臺的選擇，應選擇層流超凈臺。不能選擇平流超凈臺。超凈臺應該盡可能的安裝紫外燈。

（2）超凈臺的維護，超凈臺的HEPA過濾層應該每一年或一年后由認可的機構進行維修。1.工作環(huán)境及表面的處理（超凈臺的使用）（3）使用超凈臺的方法，在每次使用前，應用紫外燈照30分鐘。首先打開吹風的開關，在關掉紫外燈，打開日光燈。點燃酒精燈，開始操作。（4）超凈臺表面的處理。a.

應做到每日清潔，以使操作中濺出的培養(yǎng)液或其它液體及時被清除而不蓄積，達到杜絕細菌和真菌繁殖的目的。b.

工作臺中只限放置每日工作所必需的物品，其他非必須物應當除去。c.

日常的清潔工作包括：用70%的酒精或10%的新潔而滅擦洗工作臺。用固定的容器裝廢棄液。2.細胞培養(yǎng)所用玻璃及塑料制品的處理用于細胞培養(yǎng)的器材包括：細胞培養(yǎng)瓶，細胞培養(yǎng)板，吸管，各種瓶子等。目前，上述器材均可以從商家買到無菌一次性的用品。但是，成本太高。玻璃器材，經過濕熱或者干熱滅菌后可以反復使用。不宜進行高溫高壓滅菌的器材，可以浸泡在70%乙醇中進行消毒，并在超凈臺上吹干。3.實驗者的操作技術無菌操作的原則：保證細胞培養(yǎng)板，細胞培養(yǎng)皿，細胞培養(yǎng)瓶內部以及吸管包裹層等內部的無菌狀態(tài)。細胞培養(yǎng)應在超凈工作臺或有空氣濾過裝置的工作間里進行。培養(yǎng)液或其它溶液不應該在工作區(qū)以外打開。裝吸管或吸頭的容器也不應該在工作區(qū)以外打開。細胞培養(yǎng)中液體的吸取，均需機械移液裝置移取。切勿采用口吸的方法?？谖亲畲蟮奈⑸镂廴驹?，更重要的是細胞培養(yǎng)液及成分通過食入或吸入的方式及入人體，可能對研究人員造成傷害。細胞培養(yǎng)瓶在超凈臺中打開后，瓶蓋應蓋頂超下放置與工作臺中。如果培養(yǎng)的細胞已經被污染，切勿直接倒掉，應高壓滅菌后倒掉處理。濕潤的培養(yǎng)箱是常見的污染源。通常由充滿液體的托盤提供培養(yǎng)箱合適的濕度，然而托盤本身及可導致各種細菌和真菌的污染，這種污染還可能存在與培養(yǎng)箱壁上和提供氣體的管道上。應該定期對培養(yǎng)箱進行加熱處理。也可以采用70%乙醇擦洗表面，并定期更換輸送CO2管道，并將該管子浸泡與20%的含氯漂白劑中消毒。為了防止交叉污染，超凈臺中每次應進行一種細胞系的操作。不應用的細胞應及時丟棄處理，不應繼續(xù)放置于培養(yǎng)箱中不予理睬。4.細胞的處理以及維持細胞生長所需培養(yǎng)液的無菌處理?；九囵B(yǎng)液由必須氨基酸、維生素、無機鹽、葡萄糖和作為生長因子、激素和貼壁因子來源的血清組成。一般用碳酸氫鈉（NaHCO3)體系進行緩沖。細胞的生長不僅產生CO2，也需要CO2才能生存。所以，細胞的培養(yǎng)需要子在CO2培養(yǎng)箱中CO2培養(yǎng)箱中CO2的濃度應與培養(yǎng)液中碳酸氫鈉平衡。如果CO2的濃度為5%，則配培養(yǎng)液中應加入1.97g/L的碳酸氫鈉。培養(yǎng)瓶蓋應輕輕的擰上，不要完全擰死，以保證氣體的交換。培養(yǎng)液的pH值應為7.2至7.4。培養(yǎng)液的pH值應為7.2至7.4。高密度細胞使細胞培養(yǎng)液中葡萄糖耗竭并產生CO2和乳酸，在含酚紅作為指示的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液將從紅色變?yōu)槌壬?。細胞培養(yǎng)液長時間貯藏在4°C冰箱中，會使培養(yǎng)液的pH值產生變化，變堿，是培養(yǎng)液的顏色呈深品紅紫色。應用時可用Hepes（N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸）調整?？梢韵蚺囵B(yǎng)液中加入抗生素，比如青霉素，鏈霉素，慶大霉素等，抑制由于操作中的微小失誤而導致的低水平的感染。但是，有時由于抗生素的加入，也會使感染不易被迅速發(fā)現。培養(yǎng)液的配制：商家一般以三種形式提供培養(yǎng)液：1.粉末劑（需要實驗著配制）2.濃縮裝（用無菌水稀釋即可）3.無需進一步處理的工作液形式。由于粉末劑是其中最便宜的一種，一般實驗室較多采用。配制培養(yǎng)液需要濾菌裝置：除菌器、真空泵以及0.45μm或0.22μm的濾膜。培養(yǎng)液應貯藏在4°C冰箱中。配好的培養(yǎng)液應在無抗菌素的無菌條件下進行放置，每次配好后留樣，培養(yǎng)72小時，觀察培養(yǎng)液確實沒有污染后使用。學習傳代細胞的培養(yǎng)技術本次試驗應用HeLa細胞或A375-S2細胞進行傳代培養(yǎng)。HeLa細胞：人子宮頸癌細胞株A375-S2細胞：人黑色素瘤細胞株實驗材料：每組的超凈臺中有以下物品：1.50mlRPMI1640培養(yǎng)液1瓶；5ml小牛血清（FCS)1瓶；2ml胰蛋白酶1瓶；1ml谷氨酰胺1瓶；1mlHepes1瓶；PBS(-)1瓶2.滅菌1ml移液管1支；裝有試管的滅菌小飯盒1個；試管架1個；1ml，200μl移液器各1支；槍頭盒2個；細胞計數板1塊；鑷子1把，小燒杯1個；酒精燈1臺；培養(yǎng)好細胞的細胞培養(yǎng)瓶1個試驗操作步驟：1.從培養(yǎng)箱中取出細胞。在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。2.倒掉原有的細胞培養(yǎng)液，加入5mlPBS(-)洗滌2次。3.加入胰蛋白酶100-200μl，迅速前后旋轉細胞培養(yǎng)瓶4-5次，以便胰蛋白酶包被所有細胞，于37°C培養(yǎng)箱中孵育5分鐘，消化細胞。4.在顯微鏡下觀察，細胞變化。待到細胞變?yōu)榍蛐?，尚未從培養(yǎng)瓶壁上脫落下來時，用移液管吹打，使細胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落下來，加入細胞培養(yǎng)液2-5ml。5.如果細胞不能吹打下來，再放回培養(yǎng)中孵育幾分鐘。6.倒入50ml離心筒中，在向細胞培養(yǎng)瓶中加入10ml培養(yǎng)液洗滌，在一并倒入離心筒中，1000-2500轉離心，10分鐘。7.取出離心管，倒掉上清液，在桌面上輕敲離心筒，使沉降在離心筒底的細胞分散均勻。8.倒入5ml細胞培養(yǎng)液，混勻。細胞計數。9.取1104個細胞放入細胞培養(yǎng)瓶內，加入5-8ml培養(yǎng)液。10.顯微鏡下觀察。11.將傳代細胞放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12.兩天后顯微鏡下觀察細胞生長情況。細胞計數：1.按上述方法，用胰蛋白酶處理細胞，細胞重懸于細胞培養(yǎng)液中。2.用沾有70%酒精的棉球擦凈細胞計數板和蓋玻片，蓋玻片放好在細胞計數板上。3.用移液器吸取細胞標本10μl，加入10μl臺盼氏蘭溶液混勻，吸取10μl混合液從蓋玻片的一側將混合液打入蓋玻片與計數板之間。4.在顯微鏡下，計數或細胞。5.計數細胞計數板每一小室中，上下左右角和中間的大方格中（5個格）的細胞數。6.在取一細胞樣品，同上在細胞板的另一小室計細胞數。7.合計10個大方格中的細胞。算出110-3ml的細胞數。（每個大方格110-4ml10個大方格10-3ml溶劑）細胞總數乘以1000即得每毫升計數細胞懸液的細胞數。8.計數完畢，用雙蒸水清洗細胞計數板和蓋玻片。用擦凈紙擦干。每毫升細胞總數

=[(A1+B1+C1+D1+E1)+(A2+B2+C2+D2+E2)]

1032稀釋倍數第一小室的細胞總數第二小室的細胞總數活力染色：*臺盼蘭染料排斥實驗。*臺盼蘭配成0.4%w/v濃度。*加入細胞后，染料的停留不少于3分鐘，不超過10分鐘。*由于健康細胞能排斥臺盼蘭染料，但是細胞膜的完整性喪失后，染料可以進入細胞，細胞被染成藍色。所以，健康的細胞不能染上染色，而死亡的細胞被染成藍色。*臺盼蘭染色方法是一種粗略的活力測定方法，無法區(qū)別10%-20%的活力差異。贈送精美圖標1、字體安裝與設置如果您對PPT模板中的字體風格不滿意，可進行批量替換，一次性更改各頁面字體。在“開始”選項卡中，點擊“替換”按鈕右側箭頭，選擇“替換字體”。（如下圖）在圖“替換”下拉列表中選擇要更改字體。（如下圖）在“替換為”下拉列表中選擇替換字體。點擊“替換”按鈕，完成。242、替換模板中的圖片模板中的圖片展示頁面，您可以根據需要替換這些圖片，下面介紹兩種替換方法。方法一：更改圖片選中模版中的圖片（有些圖片與其他對象進行了組合，選擇時一定要選中圖片本身，而不是組合）。單擊鼠標右鍵，選擇“更改圖