受體的放射分析-核醫(yī)學與核藥學教學、學習課件

第七章受體的放射分析

§1.概論

受體:細胞表面或亞細胞組分中的一種分子，可以識別并特異地與有生物活性的化學信號物質(zhì)（配基）結(jié)合，從而激活或啟動一系列生化反應，最后導致該信號物質(zhì)特定的生物效應。迄今為止，所有已發(fā)現(xiàn)的受體都是具有特定氨基酸序列和特定構(gòu)型的蛋白質(zhì)。每一種受體在細胞上都有特定的宏觀分布和微觀分布。

一、受體功能（1）識別特異的信號物質(zhì)--配基，識別的表現(xiàn)在于兩者的特異結(jié)合。（2）把識別和接受的信號準確無誤的放大并傳遞到細胞內(nèi)部，同時啟動一系列胞內(nèi)生化反應，最后導致特定的細胞反應，使得胞間信號轉(zhuǎn)換為胞內(nèi)信號。二、受體的分類:

1、膜受體跨膜2、核受體細胞內(nèi)

受體的亞型：指受體分子結(jié)構(gòu)上既有部分相同之處，也存在部分差別，它們對一定的配基有不同的親和力，在生物學上具有各自不同的效應。受體亞型的區(qū)分是生物進化的結(jié)果，有利于機體處理信息的能力及適應性更強。受體數(shù)量：占細胞蛋白總量十萬之一到百萬分之一（一個細胞上僅有數(shù)千個受體分子），一般方法難以分離和測定受體分子。

配體：是指能和受體結(jié)合并引起相關(guān)效應的化合物。除了與受體結(jié)合外本身并無其他功能，它不能參加代謝產(chǎn)生有用產(chǎn)物，也不直接誘導任何細胞活性，更無酶的特點，它唯一的功能就是通知細胞在環(huán)境中存在一種特殊信號或刺激因素。

配體與受體的結(jié)合是一種分子識別過程，它靠氫鍵、離子鍵與范德華力的作用，隨著兩種分子空間結(jié)構(gòu)互補程度增加，相互作用基團之間距離就會縮短，作用力就會大大增加，因此分子空間結(jié)構(gòu)的互補性是特異結(jié)合的主要因素。同一配體可能有兩種或兩種以上的不同受體，例如乙酰膽堿有煙堿型和毒蕈型兩種受體，同一配體與不同類型受體結(jié)合會產(chǎn)生不同的細胞反應。如Ach可以使骨骼肌興奮，但對心肌則是抑制的。配基可以是神經(jīng)遞質(zhì)、激素、某些藥物等。三、跨膜受體的信號傳遞通路

跨膜受體是含糖或不含糖的蛋白質(zhì)分子，它的主要作用是將細胞外的信號傳導到細胞內(nèi)，信號再從細胞漿傳遞到效應器，最后是一個特定的生物學效應。信號的這種傳導過程稱為信號傳導通路（signaltransudationpathway），它是當今生物學領(lǐng)域中一個重大的研究課題。四、受體與配基結(jié)合的特性

1、可飽和性（satiability）：受體結(jié)合反應呈高親和性和低容量，而非特異結(jié)合則呈低親和性和高容量，后者的劑量反應曲線不呈可飽和性。2、可逆性（reversibility）：激素、遞質(zhì)和藥物與特異性受體結(jié)合反應是可逆的，當受體周圍的配基濃度降低，結(jié)合反應就逆向進行，即配基受體復合物很快解離，解離后的配基是原形，不起代謝變化，這跟酶與底物作用結(jié)果不同，底物經(jīng)酶作用后變成代謝產(chǎn)物。4、與效應的一致性

受體的主要功能是介導配基的生物效應，如果一種蛋白能與某種物質(zhì)結(jié)合而不介導特定的生物效應，那么這種蛋白不能稱之為受體。所以用生物效應作為觀察受體和配基性質(zhì)的標準是十分必要的。從配基的角度分析，有的是陽性效應，有的是陰性效應。陽性效應就是配基與受體結(jié)合后引起陽性生理效應，稱為激動劑。陰性效應就是配基與受體結(jié)合后不但不引起陽性生理效應，而且阻斷內(nèi)源性配基的陽性生理作用，稱為拮抗劑或阻斷劑。

五、受體的生理調(diào)節(jié)

正常生理狀態(tài)下的受體處在一個不斷合成與降解的動態(tài)平衡中，但其數(shù)量和親和性也會因疾病、藥物作用而發(fā)生變化。1、向下調(diào)節(jié)（down-regulation）

細胞所處環(huán)境中某種激動劑的濃度增高或長期作用，其結(jié)果使相應受體的數(shù)量減少，并出現(xiàn)受體對此物質(zhì)的敏感性下降，或耐受性增高等現(xiàn)象，如哮喘病人長期服用β-激動劑產(chǎn)生的耐受性增高，即藥效減弱。

六、受體與疾病遺傳缺陷與免疫異常為受體性疾病的常見原因1、基因突變致使受體異常，引發(fā)功能障礙，絕大多數(shù)是功能降低或完全喪失，有家族史，病情嚴重。如睪酮受體基因突變致該受體缺陷引起睪丸完全雌性化病。2、機體對受體產(chǎn)生自身抗體，激動（如Graves`綜合癥患者產(chǎn)生TSH受體抗體，直接持續(xù)激動甲狀腺TSH受體）或阻斷（如重癥肌無力患者產(chǎn)生N-Ach受體抗體，占領(lǐng)但不記得受體）受體。3、某些病有受體異常，非原始發(fā)病環(huán)節(jié)，為發(fā)病重要環(huán)節(jié)，采取針對措施可控制病情。甲亢用β腎上腺素阻斷劑，哮喘用β腎上腺素激動劑。4、受體與腫瘤：激素受體在腫瘤中存在與否決定治療方案（乳腺癌白血?。?；某些受體基因可突變成為癌基因，引發(fā)腫瘤?！?.受體配基結(jié)合反應的基本原理

RBA的基本原理與IRMA基本相同，應用放射性標記配體，在一定條件下與受體（R）結(jié)合成配體與受體復合物（R－*L），分離并測定R－*L的放射性，然后經(jīng)數(shù)據(jù)處理，可測得受體的親和力和受體的數(shù)量。一、受體與配基相互結(jié)合的基本規(guī)律（一）質(zhì)量作用定律（massactionlaw）

簡單單位點系統(tǒng)：指對某種受體而言，它的全部受體都以相同的親和性以單分子與特定的配基相結(jié)合，而且不表現(xiàn)明顯的正負協(xié)同作用，理論上講結(jié)合后產(chǎn)生的生物效應也應完全相同。這種系統(tǒng)稱之為。。有時，一個受體系統(tǒng)中存在兩（多）種亞型，但所用配基無選擇性，盡管亞型的生物效應可能不全相同，結(jié)合反應卻表現(xiàn)出完全相同的特征，這時，也可作為單位點系統(tǒng)來看待。（二）復合物的濃度和配基濃度的關(guān)系：

可以看出，[RL]和[LT]并非線性關(guān)系，而是曲線關(guān)系，對一定數(shù)量（[RT]固定）和一定親和力（KD固定）的受體來說，配基濃度從零開始上升時，復合物濃度先是上升很快，以后逐漸變慢，最后絕大多數(shù)受體都變?yōu)閺秃衔?，也就是受體被飽和了。這就是飽和曲線（saturationcurve)（圖9－1）。

曲線的高度主要反映受體的數(shù)量多少，曲線上升的快慢則主要反映受體和配基的親和力。

（三）非特異結(jié)合（non-specificbinding，NSB）

上述飽和曲線是受體與配基的特異結(jié)合形成的。這種結(jié)合的特點是低容量和高親和力，所以容易飽和。但是，任何受體標本除特異結(jié)合外，還會有一部分非特異結(jié)合，當分離特異結(jié)合的復合物測量放射性時，這部分非特異結(jié)合的放射性混在一起，測到的是總放射性（totalbinding，TB），必需先減去非特異結(jié)合（NSB），才能得到特異結(jié)合（specificbinding，SB）的放射性。

NSB主要來自雜蛋白，反應器壁，分離材料的吸附，它的特點是，容量很大，而親和力低，因此在一般情況下不被飽和，也就是隨著配基濃度的升高，它不呈飽和曲線，而是一條上升的直線（圖9－l）。另外，如果系統(tǒng)中存在大量同種受體的非標記配基，則放射性的SB被非標記配基取代，而NSB由于容量很大，空余的位點很多，放射性不被取代。所以要從TB中減去NSB，最基本的辦法是做一系列平行管，所有的條件都與TB管相同，只是多加100－1000倍量的非標記配基，將SB完全取代掉，這時的放射性結(jié)合即為NSB。由于NSB和放射配基呈直線關(guān)系，多點飽和法的實驗中往往只需做3－4點，再用直線回歸法求出其余各點的放射性。

（四）正負協(xié)同作用

當一部分受體與配基結(jié)合后使相鄰的受體的親和力發(fā)生改變，倘若親和力逐步下降，稱之為負協(xié)同作用如曲線（2），親和力逐步增大，稱之為正協(xié)同作用如曲線（3）。

（五）受體與配基反應的動力學（kinetics）

受體與配基的結(jié)合反應一般都較快（多數(shù)在數(shù)十秒至數(shù)十分鐘）達到平衡。當周圍的游離配基急劇下降，或非標記配基濃度急劇升高時，放射性復合物的解離也很快，這種快速結(jié)合和快速解離對保證受體的迅速反應有很重要的意義。（六）競爭性取代反應

在一個受體和放射配基的反應系統(tǒng)中加入另一個化合物，它若能和受體的結(jié)合位點結(jié)合，則會與放射配基競爭與受體結(jié)合，最終將表現(xiàn)為放射配基與受體形成復合物的能力降低，但受體數(shù)量不變,所以叫競爭性取代反應。此時，非標記的起競爭作用的配基稱為競爭劑,它們和受體結(jié)合后不改變受體分子的結(jié)構(gòu)。

表示競爭劑抑制作用強弱的指標有二個：IC50值和KI。IC50值是指抑制50％受體與放射配基結(jié)合所需競爭劑的濃度，IC50值大，表明競爭劑抑制作用小。KI則是指競爭劑的平衡解離常數(shù)，KI越小，表明競爭劑抑制作用越大。

二、雙（多）位點系統(tǒng)

一種配基可以和兩種以上的受體亞型結(jié)合，每種亞型都有相應的KD值（自學）。§3.受體放射分析的基本方法

離體RBA基本方法的流程為：

一、放射性配基的要求

制備優(yōu)良的放射性配基是受體結(jié)合試驗的首要條件。對任何一種受體系統(tǒng)，通常都有好幾種標記配基可供選擇。選擇應從兩方面考慮：①配基的特性；②實驗目的。

（一）對放射性配基的基本要求1、高比活度：組織細胞內(nèi)的受體濃度一般都很低，約104-105個/細胞，或0.01-3.0pmol/mg蛋白的水平，低比活度的配基難于達到分析靈敏度的要求。

一般要求配基比活度至少在3.7×1011Bq（10Ci）／mmol以上。另外，配基比活度高，加入反應管的放射性配基量才有可能減少，從而有利于用小量標本得到可靠的數(shù)據(jù)，并有利降低非特異性結(jié)合率。2、高親和力:親和力高，可以減少標記配基用量，從而既可降低非特異性結(jié)合，又可使放射性配基與受體的結(jié)合物解離變慢，便于進行結(jié)合和游離配基的分離。不僅方便操作，而且獲得的數(shù)據(jù)準確。

3、特異性強:即該配基與所研究受體有選擇性結(jié)合，理想的是該配基只與一種受體或受體亞型結(jié)合。但沒有一種配基是完全選擇性的，所以要結(jié)合實驗研究的目的，選擇對某一受體或其中某一亞型親和力高的放射性配基。4、高的穩(wěn)定性及放化純度:包括標記的穩(wěn)定性、貯藏時的穩(wěn)定性以及溫育分析時之穩(wěn)定性,同時具有95%以上的放化純度。

總的來說,配基的選擇要根據(jù)實驗目來定。

目前，用作受體放射分析的放射性配基多用3H、125I標記。3H標記配基與原型配基為同型式，生物學活性好，多數(shù)情況下比活度也能達到要求，且半衰期長，使用方便，主要缺點是需用液閃測量，操作較麻煩，一般實驗室不能進行標記。多肽及蛋白質(zhì)配基多用125I標記，其優(yōu)點是可以達到較高的比活度。只要很好掌握標記條件，仍能保持較好的生物活性。另外，碘標記法快速、方便、經(jīng)濟，一般實驗室可進行。（二）放射性配基的質(zhì)量鑒定1、放射化學純度:除新鮮產(chǎn)品外,存放一定時間后的標記配基均應重測其放化純度，以保證分析的準確性。一般要求放化純度應在95％以上。2、結(jié)合活性鑒定

3、比活度：受體結(jié)合分析的結(jié)果計算離不開準確的比活度數(shù)據(jù)。二、受體標本的制備

在受體結(jié)合實驗的研究中，所用的受體材料可以是組織切片，也可以是完整的單層培養(yǎng)細胞或游離活細胞，粗制的或純化的細胞膜受體，可溶性的受體蛋白等。

（一）組織切片

冷凍組織切片常用明膠粘貼于玻片上，在溫育緩沖液中與標記配基進行反應。反應后用緩沖液洗幾次即可，切片厚度一般為5-50μm。用組織切片的目的更多是研究受體的分布（用放射自顯影法或免疫組化）。

（二）游離的完整細胞懸液

完整的活細胞可以是血細胞，培養(yǎng)的單層細胞，腫瘤的腹水型細胞以及經(jīng)處理的原代細胞等，使用完整細胞的優(yōu)點：1、受體處于原有的正常環(huán)境中。膜未受擾亂，膜內(nèi)pH、離子梯度也保存著。受體與其相連的效應系統(tǒng)（如G蛋白）也保存完好。2、在受體功能反應完全的情況下研究受體，可以同時觀察配基與受體結(jié)合的情況和細胞的生物效應。所得的結(jié)果更能反映受體的生理特點。3、能直接給出平均每一個細胞的受體數(shù)。

但完整細胞的受體分析較難控制分析條件。操作過程可能導致細胞表面生理活性的改變，因此結(jié)果有時不夠穩(wěn)定。另外，若細胞上某種受體的含量低，作分析時需加入大量細胞才能獲得足夠的放射性計數(shù)，給實際工作帶來一定困難。完整細胞來源分三種：①從組織分離出游離細胞；②血細胞；③培養(yǎng)細胞。一般都需采用臺盼藍等檢查細胞活性。

（三）膜制劑（membranouspreparation）

絕大多數(shù)受體結(jié)合分析使用膜制劑。使用膜制劑可以減少非特異性結(jié)合率。而且，在膜制備過程中，通過洗膜的方法，可以將內(nèi)源性配基洗去，并除去部分蛋白溶解酶。膜制劑通常也保存有受體-效應器結(jié)合系統(tǒng)。但受體功能的其他方面則失去了。另外，膜內(nèi)離子濃度梯度、受體與細胞結(jié)構(gòu)關(guān)系也失去了。但是，受體結(jié)合需要的是膜雙層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)本身，而不是細胞內(nèi)其他組份。所以膜碎片內(nèi)仍保留受體的藥理學特性。

細胞膜和細胞漿受體的制備一般都利用蔗糖密度（0.25～0.3mol／L）梯度離心法分離不同的亞細胞組分。其優(yōu)點是除去大部分雜蛋白，以減小非特異結(jié)合。為保證所制得的膜受體保持良好的結(jié)合活性，需注意：①全部過程在0℃-4℃下進行操作。②制備緩沖液的蔗糖密度，離子強度，pH值及其它物質(zhì)（如EDTA，Mg2＋）應嚴格控制。③組織勻漿條件應保持一致。④離心的時間、速度、溫度應保持恒定。⑤為防止膜受體蛋白被蛋白酶水解常加蛋白酶抑制劑。

細胞組份的分離一般采用差速離心法。通過適當控制離心力及離心時間可使某些顆粒組份沉淀，而另一些保留在上清液中。細胞組份的一般分離流程如下：

三、結(jié)合反應的類型

（一）標記配基飽和法1、單點飽和法：定量受體制劑加大量的標記配基使受體得以飽和結(jié)合。根據(jù)受體-配基復合物的放射性計算受體結(jié)合容量（或結(jié)合位點數(shù)）。這種方法操作簡便、標本用量少。但只憑單點實驗數(shù)據(jù)計算受體結(jié)合容量，比多點法的結(jié)果略低，不能給出KD，誤差也相對大些。

2、多點飽和法：一定量的受體制劑，逐步增加標記配基的量（一般7-8個實驗點），使受體的結(jié)合趨于飽和。用曲線擬合法或直線擬合法計算受體結(jié)合容量和親和力（RT、KD），結(jié)果可靠性高。但受體標本、標記配基用量大，工作量大。

（二）非標記配基飽和法

一定量的受體制劑和標記配基，逐漸增加非標記配基（一般7－8個實驗點），使受體飽和結(jié)合，曲線擬合法或直線擬合法計算受體結(jié)合容量和親和力。這種方法克服了多點飽和法標記配基用量大的缺點，但由于非標記配基的用量逐漸加大，放射性逐步減少，必需標記配基比活度較高才能得到滿意結(jié)果。

四、分析條件的選擇

（一）標記配基濃度（二）受體濃度（三）溫育溫度與時間（四）緩沖液

五、結(jié)合與游離配基的分離

受體-配基結(jié)合分析主要是測定反應平衡時結(jié)合配基的量，求解受體的密度與平衡解離常數(shù)。反應一般在達到平衡后先經(jīng)分離，再測結(jié)合部分的放射性。理論