2-2-2-動物細胞融合技術(shù)與單克隆抗體

第二節(jié)動物細胞工程（二）二、動物細胞融合技術(shù)與單克隆抗體（一）動物細胞融合技術(shù)1、概念2、原理3、方法4、流程5、比較6、意義7、應(yīng)用1、概念動物細胞融合技術(shù)就是使兩個或多個動物細胞結(jié)合形成一個細胞的技術(shù)。融合后形成的雜交細胞具有原來兩個或多個細胞的遺傳信息。2、原理與植物原生質(zhì)體融合的基本原理相同，即細胞膜的流動性。3、方法PEG融合法、電融合法、滅活病毒誘導法等。滅活是指用物理或化學手段使病毒失去感染能力，但是并不破壞病毒的抗原結(jié)構(gòu)。滅活病毒誘導法的原理：病毒表面的糖蛋白和一些酶與細胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細胞互相凝聚，細胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細胞膜打開，細胞發(fā)生融合。相關(guān)信息4、流程動物細胞融合過程植物體細胞雜交過程去壁融合組織培養(yǎng)再生5、比較6、意義突破了有性雜交方法的局限，使遠緣雜交（種間、屬間、科間、動植物之間）成為可能。7、應(yīng)用（1）細胞融合技術(shù)已經(jīng)成為研究細胞遺傳、細胞免疫、腫瘤和培育生物新品種等的重要手段。（2）利用動物細胞融合技術(shù)發(fā)展起來的雜交瘤技術(shù)，為制造單克隆抗體開辟了新途徑。（二）單克隆抗體及其應(yīng)用1、早期獲得抗體的方法及局限2、B淋巴細胞和骨髓瘤細胞的特點3、單克隆抗體制作的流程4、思考討論5、單克隆抗體的優(yōu)點和應(yīng)用1、早期獲得抗體的方法及局限方法向動物體內(nèi)反復注射某種抗原，使動物產(chǎn)生抗體，從動物血清中分離所需抗體。缺點產(chǎn)量低、純度低、特異性差。2、B淋巴細胞和骨髓瘤細胞的特點B淋巴細胞的特點能產(chǎn)生特異性抗體，但不能無限增殖。骨髓瘤細胞的特點能大量增殖，但不能產(chǎn)生特異性抗體。旁欄思考19世紀30年代，科學家曾在患肺結(jié)核、天花和麻疹等疾病的病人病理組織中觀察到多核細胞。如何解釋這一現(xiàn)象？病人體內(nèi)的病毒等誘導多個體細胞融合形成了多核細胞。米爾斯坦科勒通過實驗，他們得到了單克隆抗體。由于發(fā)明了單克隆抗體的制備技術(shù)，米爾斯坦和科勒于1984年獲得了諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。1975年英國科學家米爾斯坦和德國科學家科勒大膽設(shè)想：B淋巴細胞骨髓瘤細胞融合細胞3、單克隆抗體制作的流程注射特定的抗原多種B淋巴細胞骨髓瘤細胞將骨髓瘤細胞與B淋巴細胞融合誘導融合培養(yǎng)骨髓瘤細胞用特定的抗原對小鼠進行免疫，并從該小鼠的脾中得到能產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細胞。3、單克隆抗體制作的流程多種雜交細胞（B-骨）（B-B）（骨-骨）用特定的選擇培養(yǎng)基進行篩選:在該培養(yǎng)基上，未融合的親本細胞和融合的具有同種核的細胞都會死亡，只有融合的雜交瘤細胞才能生長。第一次篩選：用特定的選擇培養(yǎng)基雜交瘤細胞(既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生抗體)3、單克隆抗體制作的流程第二次篩選：克隆化培養(yǎng)、抗體檢測（可進行多次）對上述經(jīng)選擇培養(yǎng)的雜交瘤細胞進行克隆化培養(yǎng)和抗體檢測，經(jīng)多次篩選，就可獲得足夠數(shù)量的能分泌所需抗體的細胞?？贵w檢測呈陽性的雜交瘤細胞(分泌的抗體能與特定抗原結(jié)合)用96孔板培養(yǎng)和篩選雜交瘤細胞，在每一個孔中盡量只接種一個雜交瘤細胞3、單克隆抗體制作的流程注射到小鼠腹腔內(nèi)體外培養(yǎng)將抗體檢測呈陽性的雜交瘤細胞在體外條件下大規(guī)模培養(yǎng)，或注射到小鼠腹腔內(nèi)增殖。從細胞培養(yǎng)液或小鼠腹水中獲取大量的單克隆抗體。單克隆抗體單克隆抗體的應(yīng)用資料1用抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體做成的“早早孕診斷試劑盒”。在妊娠第8天就可以作出診斷，這比原來的診斷方法提前了10d左右，可以避免孕婦在不知道妊娠的情況下因服用藥物而對胎兒造成不利影響。該方法檢測的準確率在90%以上。資料2使用高效的細胞毒素類藥物進行化療可以有效殺傷腫瘤細胞。但細胞毒素沒有特異性，在殺傷腫瘤細胞的同時還會對健康細胞造成傷害，這限制了它在臨床上的應(yīng)用。抗體-藥物偶聯(lián)物（antibody-drugconjugates,ADC）通過將細胞毒素與能特異性識別腫瘤抗原的單克隆抗體結(jié)合，實現(xiàn)了對腫瘤細胞的選擇性殺傷。ADC通常由抗體、接頭和藥物(如細胞毒素)三部分組成，它的作用機制如下圖所示。單克隆抗體的應(yīng)用抗體藥物接頭ADC被細胞吞噬釋放藥物溶酶體裂解細胞凋亡1.ADC的抗體和藥物各具有什么作用？討論抗體主要發(fā)揮靶向運輸作用，即通過特異性結(jié)合靶細胞表面的抗原，將連接的藥物輸送到靶細胞；藥物發(fā)揮治療效應(yīng)，如殺傷靶細胞討論2.除了細胞毒素，還有哪些物質(zhì)理論上可以作為ADC偶聯(lián)的藥物？①

可以用放射性同位素標記單克隆抗體進行靶向放療；②

一些作用于細胞信號轉(zhuǎn)導通路的藥物可以通過阻斷腫瘤細胞的信號通路來抑制其生長，理論上也可以將這些藥物與單克隆抗體結(jié)合進行治療討論3.單克隆抗體診斷試劑盒和ADC在臨床應(yīng)用上各具有什么優(yōu)勢？①

單克隆抗體診斷試劑盒中的單克隆抗體只與特定的抗原反應(yīng)，因此檢測的特異性和靈敏度大大提高；生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細胞可以傳代培養(yǎng)、冷凍保存和復蘇利用，有利于控制產(chǎn)品的質(zhì)量和標準化生產(chǎn)診斷試劑盒；②

ADC能夠協(xié)同發(fā)揮抗體特異性識別的靶向作用和細胞毒素對腫瘤細胞的殺傷作用，因此它在臨床上具有靶點清楚、毒副作用小等優(yōu)點。5、單克隆抗體的優(yōu)點和應(yīng)用優(yōu)點單克隆抗體能準確地識別抗原的細微差異，

與特定抗原發(fā)生特異性結(jié)合，并且可以大量制備。應(yīng)用(1)作為診斷試劑，如定位診斷腫瘤、心血管畸形等疾病。(2)運載藥物，如ADC。(3)治療疾病。1.動物細胞融合技術(shù)最重要的用途是（

）A.克服遠緣雜交不親和B.制備單克隆抗體C.培育新品種D.生產(chǎn)雜種細胞B2.單克隆抗體制備過程中，涉及的生物學原理是（

）①動物細胞核具有全能性②細胞膜具有一定的流動性③腫瘤細胞能無限增殖④一個漿細胞產(chǎn)生一種抗體A.①③B.②③④C.④D.①②④B3.植物體細胞雜交和動物細胞融合比較，正確的是（

）A.誘導融合的方法完全相同B.所用的技術(shù)手段基本相同C.所采用的原理完全相同D.都能形成雜種細胞D4.單克隆抗體制備過程中，對骨髓瘤細胞和B淋巴細胞誘導融合后，要用特定的選擇培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細胞。在這種培養(yǎng)基上不能存活、增殖的細胞是()①B淋巴細胞②骨髓瘤細胞③B淋巴細胞自身融合細胞④骨髓瘤細胞自身融合細胞⑤雜交瘤細胞A.①②③④B.①③⑤C.②④D.①③A5.下列有關(guān)單克隆抗體制備及其應(yīng)用的敘述，不正確的是()A.制備單克隆抗體運用的技術(shù)有動物細胞培養(yǎng)和動物細胞融合B.需要用選擇培養(yǎng)基篩選雜交瘤細胞C.需要從雜交瘤細胞中篩選出能產(chǎn)生特定抗體的細胞D.利用“ADC”治療癌癥就是利用了單克隆抗體清除癌細胞的特性DB6.如圖為細胞融合的示意圖，下列敘述正確的是(

)A．若a細胞和b細胞是植物細胞，需先去分化再誘導融合B．a(chǎn)細胞和b細胞之間的融合需要促融處理后才能實現(xiàn)C．c細胞的形成與a、b細胞膜的流動性無關(guān)D．c細胞將同時表達a細胞和b細胞中的所有基因7．下列對植物體細胞雜交和動物細胞融合的比較，描述正確的是(

)A．動物細胞融合與植物原生質(zhì)體融合的基本原理相同，誘導融合的方法也完全相同B．只有植物體細胞雜交可跨越種屬間的生殖隔離，突破有性雜交方法的局限，使遠緣雜交成為可能C．利用動物細胞融合技術(shù)而發(fā)展起來的雜交瘤技術(shù)，為生產(chǎn)單克隆抗體開辟了新途徑D．目前科學家終于實現(xiàn)了兩個植物物種間的體細胞雜交，得到了同時具有兩個物種遺傳物質(zhì)的超級植物，并使它們的性狀全部得以體現(xiàn)C8．下列關(guān)于單克隆抗體制備過程的敘述，錯誤的是(

)A．獲得B細胞之前需給動物注射特定的抗原B．分離出的B細胞應(yīng)與骨髓瘤細胞融合C．需要從融合的細胞中篩選出雜交瘤細胞D．得到的所有雜交瘤細胞產(chǎn)生的抗體均相同DB9．下圖表示用仙臺病毒誘導動物細胞融合的部分過程，下列相關(guān)敘述正確的是(

)A．細胞A和細胞B必須為同種細胞才能融合B．細胞C同時有細胞A和細胞B的遺傳物質(zhì)C．該融合過程體現(xiàn)了細胞膜具有選擇透過性D．植物細胞的融合過程與