生物分離與純化技術(生化工藝)第4章-固相析出分離技術

何謂鹽析？其原理是什么？常用的鹽是什么，影響鹽析的主要因素有哪些？有機溶劑沉淀法的原理是什么？影響有機溶劑沉析的主要因素有哪些？等電點沉點的工作原理是什么？影響結(jié)晶的因素、結(jié)晶操作。第4章固相析出分離技術固相析出：通過改變溫度、pH或加入一定的化學試劑使生化物質(zhì)在溶液中的溶解度降低而以固體形式從溶液中析出的過程。根據(jù)析出固體的特征，固相析出技術分為沉淀和結(jié)晶技術。固相析出的目的：通過固相析出達到濃縮的目的；固相析出方法可有選擇地析出雜質(zhì)或有選擇地析出所需成分，初步純化或高度純化；將已純化的產(chǎn)品由液態(tài)變成固態(tài)，加以保存或進一步處理。固相析出技術特點：操作簡單、成本低、濃縮倍數(shù)高沉淀法和結(jié)晶法是最古老的分離和純化生物物質(zhì)的方法，但目前仍廣泛應用在工業(yè)上和實驗室中。概述

鹽析概念：在高濃度的中性鹽存在下，蛋白質(zhì)（酶）等生物大分子物質(zhì)在水溶液中的溶解度降低，產(chǎn)生沉淀的過程。特點：不易導致蛋白質(zhì)變性、操作簡單、不需特殊設備，鹽析后需對蛋白質(zhì)脫鹽處理、容易引起蛋白質(zhì)共沉、一般作為粗提純方法

鹽析作用要強鹽析用鹽需有較大的溶解度鹽析用鹽必須是惰性的來源豐富、經(jīng)濟1鹽析用鹽的選擇鹽析用鹽的選擇在相同離子強度下，鹽的種類對蛋白質(zhì)溶解度的影響有一定差異，一般的規(guī)律為：半徑小的高價離子的鹽析作用較強，半徑大的低價離子作用較弱陰離子鹽析效果：檸檬酸＞PO43-＞SO42-

＞CH3COO-＞Cl-＞NO3-＞SCN-陽離子鹽析效果：NH4+＞K+＞Na+陰離子的影響大于陽離子鹽析中常用的鹽：硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀、磷酸鈉硫酸銨是最常用的蛋白質(zhì)鹽析沉淀劑鹽析用鹽的選擇缺點：（1）水解變酸；（2）高pH釋氨，腐蝕；（3）殘留產(chǎn)品有影響。一般說來，鹽濃度越大，蛋白質(zhì)的溶解度越低，但不同種類的蛋白受鹽濃度影響不同，因此可通過改變鹽濃度分別使不同的蛋白質(zhì)沉淀組成相近的蛋白質(zhì)，分子量越大，沉淀所需鹽的量越少；蛋白質(zhì)分子不對稱性越大，也越易沉淀。在進行分離的時候，一般從低鹽濃度到高濃度順次進行。2鹽濃度對鹽析效果的影響鹽析用鹽量的確定——飽和度：飽和度（Saturation）的概念：

其中：S為飽和度，c為鹽濃度，c0為鹽的飽和濃度目標蛋白質(zhì)的鹽析沉淀操作之前，所需的硫酸銨濃度或飽和濃度可通過實驗確定。對多數(shù)蛋白質(zhì)，當達到85%飽和度時，溶解度都小于0.lmg／L，通常為兼顧收率與純度，飽和度的操作范圍在40%-60%之間。3pH值對鹽析的影響一般來說，蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多溶解度越大，凈電荷越少溶解度越小，在等電點時蛋白質(zhì)溶解度最小。為提高鹽析效率，多將溶液PH值調(diào)到目的蛋白的等電點處。注意在水中或稀鹽液中的蛋白質(zhì)等電點與高鹽濃度下所測的結(jié)果是不同的，需根據(jù)實際情況調(diào)整溶液PH值，以達到最好的鹽析效果。

4溫度對鹽析的影響在低離子強度或純水中，蛋白質(zhì)溶解度在一定范圍內(nèi)隨溫度增加而增加。但在高濃度下，蛋白質(zhì)、酶和多肽類物質(zhì)的溶解度隨溫度上升而下降。在一般情況下，蛋白質(zhì)對鹽析溫度無特殊要求，可在室溫下進行，只有某些對溫度比較敏感的酶要求在0-4℃進行。5蛋白質(zhì)濃度對鹽析的影響

高濃度蛋白溶液可以節(jié)約鹽的用量，若蛋白濃度過高，會發(fā)生嚴重共沉淀作用，除雜蛋白的效果會明顯下降。在低濃度蛋白質(zhì)溶液中鹽析，所用的鹽量較多，共沉淀作用比較少，但回收率會降低。分步分離提純時，寧可選擇稀一些的蛋白質(zhì)溶液，多加一點中性鹽，使共沉淀作用減至最低限度。一般認為2.5%-3.0%的蛋白質(zhì)濃度比較適中。相當于25mg/mL～30mg/mL。鹽析操作硫酸銨的加入有以下幾種方法：1）加入固體鹽法用于要求飽和度較高而不增大溶液體積的情況；工業(yè)上常采用這種方法，加入速度不能太快，應分批加入，并充分攪拌，使其完全溶解和防止局部濃度過高；2）加入飽和溶液法用于要求飽和度不高而原來溶液體積不大的情況；它可防止局部過濃，但加量較多時，料液會被稀釋。加鹽方式鹽析條件的確定：以酵母醇脫氫酶為例，分別在不同鹽濃度下收集蛋白質(zhì)沉淀，并測定酶活力，繪制下圖鹽析操作鹽析注意事項硫酸銨的使用硫酸銨中常含有少量的重金屬離子，對蛋白質(zhì)巰基有敏感作用，使用前用H2S處理高濃度的硫酸銨溶液一般呈酸性（PH=5.0左右），使用前也需要用氨水調(diào)節(jié)至所需PH。硫酸銨容易吸潮，計算飽和度需注意

固體硫酸銨加入后體積變大加入固體鹽后體積的變化已考慮在表中；鹽析后一般放置半小時至一小時，待沉淀完全后才過濾或離心。過濾多用于高濃度硫酸銨溶液，因為此種情況下，硫酸銨密度較大，若用離心法需要較高離心速度和長時間的離心操作，耗時耗能。離心多用于較低濃度硫酸銨溶液。概念：在含有溶質(zhì)的水溶液中加入一定量親水的有機溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出。優(yōu)點在于：1）分辨能力比鹽析法高，即蛋白質(zhì)等只在一個比較窄的有機溶劑濃度下沉淀；2）沉淀不用脫鹽，過濾較為容易；缺點是1）對具有生物活性的大分子容易引起變性失活，2）操作要求在低溫下進行。3）成本高總體來說，蛋白質(zhì)和酶的有機溶劑沉淀法不如鹽析法普遍。有機溶劑沉淀法有機溶劑沉淀法機理

A降低溶劑介電常數(shù)（介電常數(shù)D有機<D水）

，減小溶劑的極性，降低帶電基團的電離度，降低蛋白質(zhì)分子間的排斥力B破壞水化膜：由于使用的有機溶劑與水互溶，它們在溶解于水的同時從蛋白質(zhì)分子周圍的水化層中奪走了水分子，破壞水化層C增大蛋白質(zhì)分子間吸引力：疏水基團暴露并有機溶劑疏水基團結(jié)合形成疏水層常用的有機溶劑沉析劑選擇依據(jù)：水溶性要好介電常數(shù)合適致變性作用要小毒性要小、揮發(fā)性適中容易獲取、廉價沉淀蛋白質(zhì)和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的是乙醇。乙醇是最常用的沉淀劑乙醇：沉析作用強，揮發(fā)性適中，無毒，常用于蛋白質(zhì)、核酸、多糖等生物大分子的沉析；丙酮：沉析作用更強，用量省，但毒性大，應用范圍不廣；

1、溫度

使用有機溶劑沉淀時，操作必須在低溫下進行，有機溶劑與水混合時，會放出大量的熱量，使溶液的溫度顯著升高，從而增加有機溶劑對蛋白質(zhì)的變性作用，有機溶劑要緩緩加入，防止溶液局部升溫。因此，所用的有機溶劑須預先冷卻到-10－-20℃；在使用有機溶劑沉淀生物高分子時，整個操作過程應在低溫下進行。

有機溶劑沉淀法的影響因素

2、pH值：

pH多控制在待沉蛋白質(zhì)的等電點附近。

3、樣品濃度：樣品較稀時，將增加有機溶劑投入量和損耗；樣品太濃會增加共沉作用。一般認為蛋白質(zhì)的初濃度以0.5～2％為好，粘多糖則以1～2％較合適。

4、中性鹽濃度：較低濃度的中性鹽存在有利于沉淀作用，減少蛋白質(zhì)變性。一般中性鹽濃度以0.01～0.05mol/L為好，常用的中性鹽為醋酸鈉、醋酸銨、氯化鈉等。

有機溶劑沉淀法的影響因素等電點沉淀法在低的離子強度下，調(diào)pH至等電點，使蛋白質(zhì)所帶凈電荷為零，降低了靜電斥力，而疏水力能使分子間相互吸引，形成沉淀的操作稱為等電點沉淀不同的兩性電解質(zhì)具有不同的等電點，以此為基礎可進行分離。生產(chǎn)胰島素時，在粗提液中先調(diào)PH8.0去除堿性蛋白質(zhì)，再調(diào)PH3.0去除酸性蛋白質(zhì)。

等電點沉淀法注意事項適用于憎水性較強的蛋白質(zhì)，例如酪蛋白在等電點時能形成粗大的凝聚物。但對一些親水性強的蛋白質(zhì)。如明膠，則在低離子強度的溶液中，調(diào)pH在等電點并不產(chǎn)生沉淀。等電點沉淀法往往不能獲得高的回收率，通常與其他沉淀方法結(jié)合使用；在調(diào)節(jié)等電點時，如果采用鹽酸、氫氧化鈉等強酸強堿，要注意防止酶的失活或蛋白變性。為了使pH緩慢變動，也可用乙酸、碳酸等弱酸和碳酸鈉等弱堿。結(jié)晶技術結(jié)晶的概念

溶液中的溶質(zhì)在一定條件下，因分子有規(guī)則的排列而結(jié)合成晶體，晶體的化學成分均一，具有各種對稱的晶體，其特征為離子和分子在空間晶格的結(jié)點上呈規(guī)則的排列結(jié)晶與沉淀相比析出速度慢，溶質(zhì)分子有足夠時間進行排列，粒子排列有規(guī)則結(jié)晶的特點只有同類分子或離子才能排列成晶體，因此結(jié)晶過程有良好的選擇性。通過結(jié)晶，溶液中大部分的雜質(zhì)會留在母液中，再通過過濾、洗滌，可以得到純度較高的晶體結(jié)晶過程具有成本低、設備簡單、操作方便，廣泛應用于氨基酸、有機酸、抗生素、維生素、核酸等產(chǎn)品的精制。結(jié)晶的過程溶質(zhì)在溶劑中存在兩個過程：固體溶解與溶質(zhì)沉積結(jié)晶包含三個過程：一、過飽和溶液的形成二、晶核的形成三、晶體的生長一、過飽和溶液的形成過飽和溶液形成的方法：飽和溶液冷卻蒸發(fā)溶劑化學反應結(jié)晶：將溶質(zhì)轉(zhuǎn)化為溶解度更低的物質(zhì)解析法：向溶液中加入某些沉淀劑，降低溶質(zhì)的溶解度從而使溶質(zhì)析出沉淀（73頁）二、晶核的形成晶核：是過飽和溶液中最先析出的微小顆粒，直徑在幾納米至幾十微米，它是晶體凝結(jié)中心。成核速度：單位時間內(nèi)在單位體積的溶液中形成的晶核數(shù)目，成核速度決定晶體的大小，也對晶體純度有較大影響。成核速度快導致晶體細小。影響成核的因素過飽和度：c為過飽和溶液的濃度，c0為飽和溶液濃度溫度：影響溶質(zhì)的溶解度和分子運動速度溶質(zhì)種類：分子結(jié)構越復雜、分子量越大越不溶液成核。A穩(wěn)定區(qū)：不飽和區(qū)B第一介穩(wěn)區(qū)：不產(chǎn)新晶核，溶液可以穩(wěn)定存在，但加入晶種結(jié)晶會生長C第二介穩(wěn)區(qū)：加入晶種結(jié)晶會生長，同時有新晶核產(chǎn)生D不穩(wěn)區(qū)：瞬時出現(xiàn)大量微小晶核，發(fā)生晶核泛濫，容易析出沉淀晶核的誘導很多生物分子自發(fā)成核機會很小，