人胃腸癌類器官藥物敏感性測(cè)試管理規(guī)范

I人胃腸癌類器官藥物敏感性測(cè)試管理規(guī)范范圍本文件規(guī)定了人胃腸癌患者來(lái)源的腫瘤類器官的倫理、技術(shù)和管理等要求。本文件適用于人胃腸癌患者來(lái)源的腫瘤類器官藥物敏感性測(cè)試的操作規(guī)范、流程管理和使用指引。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T37864生物樣本庫(kù)質(zhì)量和能力通用要求WS213丙型肝炎診斷WS293艾滋病和艾滋病病毒感染診斷標(biāo)準(zhǔn)WS299乙型病毒性肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)類器官藥物敏感性檢測(cè)指導(dǎo)腫瘤精準(zhǔn)治療臨床應(yīng)用專家共識(shí)(2022年版)腫瘤類器官診治平臺(tái)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)中國(guó)專家共識(shí)(2022年版)中華人民共和國(guó)藥典（2020年版）全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程涉及人的生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究倫理審查辦法（2023年版）術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1類器官organoids由干細(xì)胞或前體細(xì)胞體外培養(yǎng)形成的，包含組織器官特異性的多種細(xì)胞，能自我更新，具有特定器官關(guān)鍵結(jié)構(gòu)和功能特性的三維（3D）細(xì)胞培養(yǎng)物。3.2腫瘤類器官tumoroids由患者的腫瘤組織或其他含腫瘤細(xì)胞的樣本中提取的腫瘤細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)而成的，可以在體外擴(kuò)增并重現(xiàn)原始腫瘤病理形態(tài)、遺傳特征和治療反應(yīng)特征的類器官。3.3人胃癌類器官humangastriccancerorganoids由病理診斷為胃癌患者的胃腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)而成的具有胃癌特征的腫瘤類器官。3.4人腸癌類器官humanintestinalcancerorganoids由病理診斷為腸癌患者的腸腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)而成的具有腸癌特征的腫瘤類器官。3.5類器官傳代organoidpassage體外培養(yǎng)的類器官經(jīng)過(guò)物理、化學(xué)或生物等處理方法，將原有類器官分成更小細(xì)胞簇甚至是單細(xì)胞，重新接種到與原培養(yǎng)條件相同的新培養(yǎng)體系中進(jìn)行體外培養(yǎng)的過(guò)程。3.6類器官凍存organoidcryopreservation類器官暫時(shí)脫離生長(zhǎng)狀態(tài)并保持其細(xì)胞組成、基因表達(dá)特征及功能特性的低溫冷凍過(guò)程。3.7類器官?gòu)?fù)蘇organoidthawing凍存的類器官重新獲得生長(zhǎng)和代謝活力的過(guò)程。3.8類器官藥物敏感性測(cè)試Organoidsdrugsensitivitytesting將多種藥物組合或單獨(dú)的藥物作用于類器官進(jìn)行藥效、毒性評(píng)估的過(guò)程，簡(jiǎn)稱類器官藥敏測(cè)試。縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。DAB：二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine）DMSO：二甲基亞砜（DimethylSulfoxide）DNA：脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）HBV：乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus）HCV：丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus）HIV：人免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus）H&E：蘇木精-伊紅（HematoxylinandEosin）PBS：磷酸鹽緩沖液（PhosphateBufferSaline）PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction）STR：短串聯(lián)重復(fù)序列（ShortTandemRepeat）倫理要求5.1人胃癌和人腸癌類器官的倫理審查要求依照國(guó)家衛(wèi)生健康委、教育部、科技部、國(guó)家中醫(yī)藥局發(fā)布的《涉及人的生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究倫理審查辦法》（2023年版）進(jìn)行審查。5.2應(yīng)與類器官原組織供者簽署書面的合法有效的知情同意通知書，包括但不限于：合適條件下潛在研究及治療的應(yīng)用、研究成果潛在的商業(yè)應(yīng)用及其他問(wèn)題所適用的內(nèi)容。應(yīng)對(duì)類器官原組織供者個(gè)人信息進(jìn)行隱私保護(hù)。5.3人胃癌和腸癌組織的采集、人胃癌和腸癌類器官的生產(chǎn)，以及利用人胃癌和腸癌類器官開(kāi)展科學(xué)研究、產(chǎn)品開(kāi)發(fā)、臨床藥敏測(cè)試等相關(guān)活動(dòng)均需經(jīng)過(guò)倫理審查委員會(huì)審查通過(guò)。類器官要求6.1形態(tài)學(xué)特征人胃癌類器官在光學(xué)顯微鏡下呈現(xiàn)囊泡型、致密型或混合型等多種形態(tài)特征；人腸癌類器官在光學(xué)顯微鏡下應(yīng)邊緣清晰、透亮，由細(xì)胞簇組合而成，呈現(xiàn)致密型、松散型、囊泡型或混合型等形態(tài)特征。體外三維培養(yǎng)類器官，可使用光學(xué)顯微鏡觀察，光學(xué)顯微鏡的倍數(shù)參照類器官的直徑大小選擇。6.2組織病理學(xué)特征類器官中的細(xì)胞應(yīng)與原腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞的異型性特征保持一致，如核深染、異常核分裂象、核質(zhì)比失調(diào)等。應(yīng)對(duì)類器官進(jìn)行相關(guān)標(biāo)志物檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果應(yīng)與原腫瘤組織結(jié)果基本一致，一致性不低于50%。人胃癌類器官檢測(cè)的標(biāo)志物包括但不限于CEA、CA19-9和Ki67，人腸癌類器官檢測(cè)的標(biāo)志物包括但不限于CDX2、CK20、CK7和Ki67?？砂凑崭戒汚檢測(cè)。6.3基因遺傳特征應(yīng)對(duì)類器官進(jìn)行基因變異檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果應(yīng)與原腫瘤組織的基因變異結(jié)果基本一致。人胃癌類器官和人腸癌類器官應(yīng)檢測(cè)的腫瘤相關(guān)熱點(diǎn)基因包括但不限于TP53、KRAS、NRAS、ERBB2、BRAF、NTRK1、ARID1、ARBB2、MUC6、RHOA、RNF43、APC、SMAD4、CDH1和PIK3CA?？砂凑崭戒汢檢測(cè)。體外生長(zhǎng)特征從胃、腸癌患者來(lái)源的人胃、腸癌組織或細(xì)胞，初次在體外培養(yǎng)成人胃腸癌類器官后，應(yīng)能在體外維持培養(yǎng)2個(gè)月，或應(yīng)能傳代至少3代，且類器官數(shù)量應(yīng)保持穩(wěn)定。當(dāng)類器官傳代后，應(yīng)能體外重新生長(zhǎng)成為新的類器官，重新生長(zhǎng)的類器官和傳代前類器官的形態(tài)學(xué)特征、組織病理學(xué)特征和遺傳特征應(yīng)保持一致。存活率復(fù)蘇的類器官存活率應(yīng)不低于50%?？砂凑崭戒汣檢測(cè)。6.6微生物支原體、細(xì)菌、真菌、HIV、HBV、HCV、外源病毒因子等應(yīng)為陰性。支原體按照《中華人民共和國(guó)藥典》（2020年版）中“3301支原體檢查法”檢測(cè)。細(xì)菌及真菌按照《中華人民共和國(guó)藥典》（2020年版）中“1101無(wú)菌檢查法”檢測(cè)。HIV按照WS293核酸法檢測(cè)。HBV按照WS299核酸法檢測(cè)。HCV按照WS213核酸法檢驗(yàn)。外源病毒因子按照《中華人民共和國(guó)藥典》（2020年版）中“3302外源病毒因子檢查法”檢測(cè)。體外培養(yǎng)的類器官，進(jìn)行STR檢測(cè)及分型鑒定，應(yīng)與供體STR一致?？砂凑崭戒汥檢測(cè)。成瘤性當(dāng)人胃腸癌類器官通過(guò)體內(nèi)異種移植的方式接種于免疫缺陷小鼠后，應(yīng)能形成腫瘤。可按照附錄E檢測(cè)。類器官管理要求標(biāo)識(shí)應(yīng)建立培養(yǎng)、驗(yàn)證、記錄和維護(hù)等相關(guān)人胃腸癌類器官的規(guī)程。應(yīng)建立人胃腸癌類器官的唯一標(biāo)識(shí)。此唯一標(biāo)識(shí)應(yīng)至少包括類器官名稱、樣品編號(hào)或批號(hào)，應(yīng)有與供者相關(guān)的信息代碼。應(yīng)記錄人胃腸癌類器官培養(yǎng)信息，包括但不限于培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)人員、培養(yǎng)方法、類器官名稱等。凍存應(yīng)建立人胃腸癌類器官凍存規(guī)范。凍存過(guò)程應(yīng)控制細(xì)胞密度、細(xì)胞活率、冷凍速率等，并選擇使用適當(dāng)?shù)睦鋬霰Ｗo(hù)劑，并對(duì)冷凍過(guò)程進(jìn)行記錄，包括但不限于：類器官名稱、批號(hào)、代數(shù)、凍存日期、凍存人員、類器官數(shù)量等。應(yīng)按照GB/T37864要求對(duì)人胃腸癌類器官進(jìn)行儲(chǔ)存。應(yīng)對(duì)每批儲(chǔ)存的人胃腸癌類器官進(jìn)行記錄，記錄內(nèi)容包括但不限于：類器官名稱、批號(hào)、儲(chǔ)存日期、儲(chǔ)存位置和存儲(chǔ)數(shù)量等。7.3運(yùn)輸供應(yīng)方應(yīng)制定人胃腸癌類器官運(yùn)輸規(guī)程并實(shí)施。應(yīng)按照GB/T37864要求進(jìn)行運(yùn)輸，并根據(jù)人胃腸癌類器官的使用需求選擇適當(dāng)?shù)倪\(yùn)輸方式和運(yùn)輸條件。人胃腸癌類器官應(yīng)以凍存狀態(tài)或以生長(zhǎng)狀態(tài)的方式運(yùn)輸，根據(jù)規(guī)程控制運(yùn)輸條件包括但不限于：溫度、防污染措施、適當(dāng)?shù)陌b等，并告知接收方相關(guān)信息。人胃腸癌類器官的運(yùn)輸應(yīng)記錄以下方面，包括但不限于：運(yùn)輸方式和條件、運(yùn)輸路線、聯(lián)系方式和收件人信息等。應(yīng)在必要時(shí)檢查運(yùn)輸中的包裹，并在可能的情況下添加新的冷凍源（如干冰和液氮）以保持適宜的運(yùn)輸溫度。7.4使用說(shuō)明應(yīng)按照GB/T37864要求進(jìn)行人胃腸癌類器官分發(fā)。使用前，應(yīng)由人胃腸癌類器官接收方提交申請(qǐng)，并經(jīng)供應(yīng)方根據(jù)其正式程序進(jìn)行審批。供應(yīng)方與用戶簽署MTA或同等條款和條件文件。供應(yīng)方應(yīng)向用戶提供相關(guān)信息包括但不限于：可追溯的批號(hào)、質(zhì)量證明、培養(yǎng)方法、凍存方法、凍存日期、建庫(kù)日期、微生物檢測(cè)數(shù)據(jù)、匿名化的類器官供者的知情同意書副本等。類器官藥敏測(cè)試8.1藥物板應(yīng)建立人胃腸癌類器官藥物板的管理規(guī)范，包括但不限于：藥物配制時(shí)間、藥物配制人員、取用記錄和藥物板維護(hù)等相關(guān)類器官藥物篩選的規(guī)程。應(yīng)建立人胃腸癌類器官藥物板的詳細(xì)標(biāo)識(shí)，此標(biāo)識(shí)表包括但不限于藥物名稱、藥物位置、藥物濃度范圍、藥物體積、配制日期、有效期記錄、配制人員等。應(yīng)結(jié)合藥物種類、藥物溶劑、藥物的有效儲(chǔ)存條件等選擇合適的藥物儲(chǔ)存條件，存儲(chǔ)條件控制內(nèi)容包括但不限于：存儲(chǔ)溫度、防污染措施、封膜處理等，并記錄相應(yīng)儲(chǔ)存條件下藥物的有效期、儲(chǔ)存日期、儲(chǔ)存位置等信息。且應(yīng)對(duì)每批儲(chǔ)存的藥物板進(jìn)行記錄，記錄內(nèi)容包括但不限于：藥物板名稱、藥物數(shù)目、藥物批號(hào)等。供應(yīng)方應(yīng)制定人胃腸癌類器官藥物板的運(yùn)輸規(guī)程并實(shí)施。根據(jù)藥物板的使用需求選擇適當(dāng)?shù)倪\(yùn)輸方式和運(yùn)輸條件，必要時(shí)檢查運(yùn)輸中的包裹，并在可能的情況下添加新的冷凍源以保持適宜的運(yùn)輸溫度。且應(yīng)記錄藥物板運(yùn)輸記錄，包括但不限于：運(yùn)輸方式和條件、運(yùn)輸路線、聯(lián)系方式和收件人信息等。8.2類器官用于臨床藥敏測(cè)試的人胃腸癌類器官應(yīng)符合第6章的技術(shù)要求，且類器官代數(shù)應(yīng)不超過(guò)20。8.3操作流程8.3.1儀器和設(shè)備準(zhǔn)備：微孔板、移液工作站/自動(dòng)分液器、自動(dòng)微量加樣器、化學(xué)發(fā)光細(xì)胞活性分析系統(tǒng)。8.3.2試劑準(zhǔn)備：基質(zhì)膠、人胃腸癌類器官培養(yǎng)基、藥物板、ATP活性檢測(cè)試劑、Staurosporine、蛋白酶抑制劑Mg132。8.3.3檢測(cè)步驟8.3.3.1收集數(shù)目合適且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的人胃腸癌類器官，用PBS洗去基質(zhì)膠后，離心收集類器官。8.3.3.2采用機(jī)械或酶解法消化人胃腸癌類器官成單細(xì)胞，用預(yù)混5%～50%基質(zhì)膠的人胃腸癌類器官培養(yǎng)基重懸細(xì)胞或用基質(zhì)膠預(yù)先包被板底后鋪入單細(xì)胞懸液。使用自動(dòng)分液器將單細(xì)胞混液按合適數(shù)目進(jìn)行鋪板，孔間細(xì)胞密度要求一致。8.3.3.3根據(jù)藥物的有效抑制濃度范圍合理設(shè)計(jì)藥物工作劑量梯度，并預(yù)設(shè)好藥物板上各藥物的位置及濃度分布孔位。按藥物說(shuō)明書選擇合適溶劑溶解藥物配成合適的儲(chǔ)液濃度，將儲(chǔ)液藥物依次稀釋到相應(yīng)的工作劑量濃度并移至對(duì)應(yīng)的藥物板空位。8.3.4藥物處理8.3.4.1提前設(shè)置好藥物處理分組，陰性對(duì)照組、藥物處理組和陽(yáng)性對(duì)照組。8.3.4.2提前預(yù)設(shè)好人胃腸癌類器官單細(xì)胞板上藥物處理的組別、濃度和加樣位置。8.3.4.3在藥物處理前后觀察且記錄類器官的生長(zhǎng)特征，用微量加樣器將藥物板上對(duì)應(yīng)的藥液按相應(yīng)濃度移至上述細(xì)胞板位置。8.3.5細(xì)胞活性檢測(cè)8.3.5.1按ATP化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書對(duì)細(xì)胞活性進(jìn)行檢測(cè)。8.3.5.2使用化學(xué)發(fā)光細(xì)胞活性檢測(cè)儀對(duì)加入細(xì)胞活性ATP檢測(cè)試劑的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，得到各實(shí)驗(yàn)藥物組細(xì)胞RLU數(shù)值并分析上述各組的細(xì)胞活性變化。8.3.6結(jié)果分析與判讀8.3.6.1藥物溶劑和空白組為陰性對(duì)照組，藥物處理組為各濃度梯度的藥物，蛋白酶抑制劑Mg132或Staurosporine處理組為陽(yáng)性對(duì)照組。陰性對(duì)照組細(xì)胞活性應(yīng)最強(qiáng)。8.3.6.2類器官細(xì)胞活性按照公式（F.1）進(jìn)行計(jì)算：CV=（CV藥物/CV對(duì)照）×100%（F.1）式中：CV—類器官細(xì)胞相對(duì)活力；CV藥物—藥物處理組類器官細(xì)胞活力；CV對(duì)照—陰性對(duì)照組類器官細(xì)胞活力。8.3.7計(jì)算與分析按上式計(jì)算各藥物濃度劑量下的細(xì)胞活力，保證至少三次技術(shù)重復(fù)，結(jié)合藥物濃度，繪制劑量反應(yīng)曲線，得出IC50。8.3.8結(jié)果判讀類器官藥物反應(yīng)結(jié)果與臨床療效的一致性比較依照共識(shí)進(jìn)行判讀。8.4流程管理應(yīng)記錄人胃腸癌類器官藥物篩選信息，包括但不限于類器官名稱、類器官代數(shù)、類器官的數(shù)目、測(cè)試藥物名稱、測(cè)試藥物數(shù)目、藥物篩選人員等。應(yīng)建立人胃腸癌類器官藥敏測(cè)試實(shí)驗(yàn)規(guī)范，應(yīng)按照《腫瘤類器官診治平臺(tái)的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)中國(guó)專家共識(shí)（2022年版）》和《類器官藥物敏感性測(cè)試指導(dǎo)腫瘤精準(zhǔn)治療臨床應(yīng)用專家共識(shí)（2022年版）》（以下簡(jiǎn)稱“共識(shí)”）要求進(jìn)行藥敏測(cè)試，包括但不限于：患者知情同意授權(quán)、入組患者人群、藥物測(cè)試選擇、藥物測(cè)試結(jié)果判讀、患者個(gè)性化治療方案選擇等。應(yīng)按照共識(shí)要求記錄人胃腸癌類器官藥敏實(shí)驗(yàn)，記錄內(nèi)容包括但不限于：人胃腸癌組織原代處理圖片、類器官培養(yǎng)成功圖片、類器官的數(shù)目/直徑變化、用藥前后類器官的形態(tài)學(xué)變化、藥物劑量變化曲線、細(xì)胞活力量化結(jié)果統(tǒng)計(jì)等。應(yīng)按照共識(shí)要求在具有測(cè)試資質(zhì)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)或第三方檢測(cè)單位進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，測(cè)試結(jié)束后應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果出具測(cè)試報(bào)告，報(bào)告內(nèi)容包括但不限于腫瘤生長(zhǎng)抑制率、半數(shù)抑制濃度、二分類法或三分類法區(qū)分出藥物抑制效果等。由于胃、腸腫瘤的復(fù)雜性，應(yīng)按照共識(shí)要求在臨床診療過(guò)程中進(jìn)行多學(xué)科討論，依據(jù)患者具體病情、病理結(jié)果及患者原始癌組織的基因測(cè)試結(jié)果綜合判斷胃癌或腸癌類器官藥敏報(bào)告，為患者制定安全、潛在獲益的單藥、聯(lián)合用藥策略。

附錄A（資料性）類器官組織病理檢測(cè)石蠟包埋法A.1儀器和設(shè)備石蠟包埋儀、石蠟切片機(jī)、組織攤片機(jī)、光學(xué)顯微鏡。A.2試劑A.2.1石蠟切片制備試劑：按照相應(yīng)要求配制石蠟包埋需要試劑，包括固定液、脫水液、石蠟、脫蠟液、復(fù)水液、乙醇、二甲苯、中性樹(shù)脂。A.2.2H&E染色試劑：蘇木精、伊紅。A.2.3除特別說(shuō)明外，所用試劑均為分析純，檢測(cè)用水均為去離子水。A.3檢測(cè)步驟A.3.1樣品準(zhǔn)備和固定取體外培養(yǎng)的類器官，用移液器吸出類器官和基質(zhì)膠混合物，轉(zhuǎn)移至15mL離心管內(nèi)，離心棄上清，用4%多聚甲醛固定類器官15min-30min。A.3.2類器官石蠟切片制作按照石蠟切片制作方法對(duì)類器官樣品進(jìn)行固定，脫水，透明后浸入石蠟中，用石蠟包埋儀器進(jìn)行包埋。用石蠟切片機(jī)切成標(biāo)準(zhǔn)厚度，制成石蠟切片。A.3.3H&E染色將類器官石蠟切片進(jìn)行脫蠟，復(fù)水，用蘇木精染色，分化后沖水。接著用伊紅染色，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片。A.3.4免疫組化染色將類器官石蠟切片進(jìn)行脫蠟，復(fù)水，抗原修復(fù)，加封閉液進(jìn)行封閉。加一抗孵育，PBS清洗。加對(duì)應(yīng)二抗，PBS清洗。用DAB進(jìn)行顯色，加水終止顯色反應(yīng)。蘇木精襯染，鹽酸透明后沖水。乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片。A.4結(jié)果分析得到的檢測(cè)結(jié)果由具有病理診斷資質(zhì)的人員分析和判定，并與原腫瘤組織病理檢測(cè)結(jié)果具有一致性。

附錄B（資料性）類器官基因突變檢測(cè)測(cè)序法B.1儀器和設(shè)備離心機(jī)、-80℃冰箱、超微量分光光度計(jì)。B.2試劑按相應(yīng)要求準(zhǔn)備的細(xì)胞DNA抽提試劑盒。B.3樣品保存樣品制備好后，于-80℃以下保存。B.4檢測(cè)步驟B.4.1樣品制備將類器官在基質(zhì)膠中培養(yǎng)至穩(wěn)定生長(zhǎng)狀態(tài)，用移液器吹打基質(zhì)膠，至基質(zhì)膠破碎后，混合液收集于離心管中，離心收集類器官，棄上清。B.4.2DNA提取按細(xì)胞DNA抽提試劑盒說(shuō)明書對(duì)類器官基因組DNA進(jìn)行提取，提取后的DNA使用超微量分光光度計(jì)進(jìn)行濃度和質(zhì)量檢測(cè)。B.4.3測(cè)序?qū)㈩惼鞴貲NA樣本和原腫瘤組織送至具有臨床基因檢測(cè)資質(zhì)的機(jī)構(gòu)進(jìn)行一代測(cè)序或二代測(cè)序檢測(cè)，或采用ARMS法、ddPCR法等對(duì)基因位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。B.5結(jié)果分析分析基因突變位點(diǎn)，比較類器官測(cè)序和原腫瘤組織測(cè)序結(jié)果的一致性。

附錄C（資料性）類器官存活率檢測(cè)鈣黃綠素AM染色法C.1儀器和設(shè)備倒置熒光顯微鏡、光學(xué)顯微鏡、細(xì)胞培養(yǎng)箱。C.2試劑C.2.1細(xì)胞級(jí)別DMSO。C.2.2PBS（pH為7.4）。C.2.3儲(chǔ)存液的配制（鈣黃綠素AM溶液）：用細(xì)胞級(jí)別DMSO制備2mmol/L的鈣黃綠AM素溶液。C.2.4除特別說(shuō)明外，所用試劑均為分析純，檢測(cè)用水均為去離子水。C.3檢測(cè)步驟C.3.1類器官總數(shù)量計(jì)數(shù)將體外培養(yǎng)的類器官置于光學(xué)顯微鏡下，觀察其形態(tài)和狀態(tài)，通過(guò)肉眼觀察來(lái)確定類器官是否存活。C.3.2活類器官數(shù)量計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，取出已經(jīng)配置好的鈣黃綠素AM儲(chǔ)存液，加入鈣黃綠素AM溶液到培養(yǎng)基中至終濃度為0.2μmol/L。隨后在37℃條件下孵育60min。到達(dá)時(shí)間后，用PBS緩慢清洗掉帶有鈣黃綠素AM的培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基。用490nm激發(fā)波長(zhǎng)，515nm發(fā)射波長(zhǎng)的濾光片的熒光顯微鏡觀察類器官并斷層掃描拍照?；铑惼鞴僭跓晒怙@微鏡下顯示為綠色且邊緣清晰。對(duì)直徑≥20μm的活類器官計(jì)數(shù)。C.4類器官存活率計(jì)算符合6.1類器官形態(tài)要求，對(duì)直徑≥20μm的類器官計(jì)數(shù)。類器官存活率按照公式（C.1）進(jìn)行計(jì)算：X=（N活/N總）×100%（C.1）式中：X—類器官存活率；N活—活類器官數(shù)量；N總—總類器官數(shù)量。C.5計(jì)算與分析按照C.3步驟再重復(fù)兩次，計(jì)算三次活類器官比率結(jié)果的平均值，記為類器官平均存活率。C.6精密度在重復(fù)性條件下獲得的三次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不應(yīng)超過(guò)算術(shù)平均值的10%。?

附錄D（資料性）類器官STR鑒定D.1儀器和設(shè)備離心機(jī)、PCR儀、毛細(xì)管電泳儀、微量紫外分光光度計(jì)、-80℃冰箱。D.2試劑細(xì)胞DNA抽提試劑盒、STR細(xì)胞鑒定試劑盒。D.3樣品保存樣品制備好后，于-80℃以下保存。D.4檢測(cè)步驟D.4.1樣品制備將類器官在基質(zhì)膠中培養(yǎng)至穩(wěn)定生長(zhǎng)狀態(tài)，用移液器吹打基質(zhì)膠，至基質(zhì)膠破碎后，混合液收集于離心管中，離心收集類器官，棄上清。D.4.2DNA提取D.4.2.1按細(xì)胞DNA抽提試劑盒說(shuō)明書對(duì)類器官和原腫瘤組織基因組DNA進(jìn)行提取；D.4.2.2紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取后的DNA的吸光度A260/A280的比值在1.8~2.0之間；D.4.2.3DNA樣本要求：DNA體積≥20μL，濃度≥50ng/μL。D.4.3PCR擴(kuò)增D.4.4.1按照標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增方法對(duì)STR位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，也可以按照經(jīng)過(guò)質(zhì)檢合格的商業(yè)化試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。D.4.4.2設(shè)置陰性對(duì)照組、樣本檢測(cè)組和陽(yáng)性對(duì)照組。陰性對(duì)照組采用無(wú)菌水為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，樣本檢測(cè)組以類器官和原腫瘤組織樣本提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，陽(yáng)性對(duì)照組采用DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增。D.4.4.3采用瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組。陰性對(duì)照組無(wú)目的條帶，陽(yáng)性對(duì)照組有清晰的目的條帶。D.4.4STR基因分型檢測(cè)使用毛細(xì)管電泳基因分析儀對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，并得到STR遺傳圖譜數(shù)據(jù)。陽(yáng)性對(duì)照組有清晰的目的條帶。類器官與原腫瘤組織的擴(kuò)增條帶應(yīng)該一致。D.5結(jié)果分析D.5.1當(dāng)STR位點(diǎn)的等位基因含有相同重復(fù)次數(shù)時(shí)，圖譜僅出現(xiàn)1個(gè)等位基因峰；當(dāng)含有不同重復(fù)次數(shù)時(shí)，圖譜會(huì)出現(xiàn)2個(gè)等位基因峰。且當(dāng)陰性對(duì)照組無(wú)等位基因峰出現(xiàn)，陽(yáng)性對(duì)照組檢測(cè)結(jié)果與其標(biāo)準(zhǔn)基因分型數(shù)據(jù)一致時(shí)視為有效檢測(cè)。D.5.2在檢測(cè)有效的前提下，若受檢樣本STR位點(diǎn)出現(xiàn)2個(gè)以上的等位基因峰，經(jīng)過(guò)重復(fù)實(shí)驗(yàn)排除引物結(jié)合區(qū)突變等干擾因素后，判定受檢樣本存在交叉污染。?

附錄E(資料性)成瘤性檢測(cè)人胃腸癌類器官皮下成瘤實(shí)驗(yàn)E.1儀器和設(shè)備接種針、游標(biāo)卡尺、體重秤、4℃冰箱。E.2試劑基質(zhì)膠。E.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物NSG（NODscidgamma）或NCG（NODCRISPRPrkdcIl2rgamma）免疫缺陷小鼠，4-6周鼠齡。E.4檢測(cè)步驟E.4.1樣本制備收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好且數(shù)量合適的人胃腸癌類器官，并通過(guò)50%基質(zhì)膠進(jìn)行重懸，置于4℃?zhèn)溆?。E.4.2皮下移植用接種針將人胃腸癌類器官注射到周齡為4-6周的免疫缺陷小鼠皮下，每個(gè)類器官樣本需要保證至少兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)，并在注射后觀察和記錄小鼠皮下腫瘤的生長(zhǎng)情況。E.4.3皮下腫瘤收集對(duì)皮下腫瘤進(jìn)行收集，記錄并拍照。E.5結(jié)果分析E.5.1皮下腫瘤大小計(jì)算E.5.1.1皮下腫瘤體積計(jì)算皮下腫瘤體積按照公式（E.1）進(jìn)行計(jì)算：V（cm3）=1/2×長(zhǎng)徑×短徑2（E.1）式中：V—腫瘤體積；長(zhǎng)徑—腫塊最長(zhǎng)兩點(diǎn)的距離短徑—腫塊最短兩點(diǎn)的距離。E.5.1.2計(jì)算與分析計(jì)算多次腫瘤大小結(jié)果的平均值，記為腫塊的大小。E.5.2皮下腫瘤組織病理學(xué)檢測(cè)按照附錄A檢測(cè)。參?考?文?獻(xiàn)[1]國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委.涉及人的生物醫(yī)學(xué)研究理論審查辦法，2016[2]科技教育司-國(guó)衛(wèi)科教.涉及人的生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究倫理審查辦法，2023[3]GB/T37864-2019生物樣本庫(kù)質(zhì)量和能力通用要求[4]GB/T42466-2023生物樣本庫(kù)多能干細(xì)胞管理技術(shù)規(guī)范[5]T/CSCB0001-2020干細(xì)胞通用要求[6]T/CSCB0005-2022人腸道類器官[7]T/CSCB0006-2022人腸癌類器官[8]T/CSCB0009-2022人干細(xì)胞研究倫理審查技術(shù)規(guī)范[9]中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)指南工作委員會(huì).中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)(CSCO)胃癌診療指南2023[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2023.[10]中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)腫瘤多學(xué)科診療專業(yè)委員會(huì),中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)腫瘤內(nèi)分泌專業(yè)委員會(huì).腫瘤類器官診治平臺(tái)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)中國(guó)專家共識(shí)（2022年版）[J].中國(guó)癌癥雜志,2022,32(07):657-668.[11]類器官藥物敏感性檢測(cè)指導(dǎo)腫瘤精準(zhǔn)治療臨床應(yīng)用專家共識(shí)(2022年版)[J].中國(guó)癌癥防治雜志,2022,14(03):234-239.[12]中華人民共和國(guó)藥典（2020年版）[13]CancerGenomeAtlasResearch,N.(2014).Comprehensivemolecularcharacterizationofgastricadenocarcinoma.Nature513,202-209.[14]Yan,H.H.N.,etal.(2018).AComprehensiveHumanGastricCancerOrganoidBiobankCapturesTumorSubtypeHeterogeneityandEnablesTherapeuticScreening.CellStemCell23,882-897e811.[15]LinH,WangY,ChengC,QianY,HaoJ,ZhangZ,ShengW,SongL,DengCX,ZhaoB,CaoJ,WangL,WangL,LiangL,ChenWK,YuC,SunZ,YangY,WangC,ZhangY,LiQ,LiK,MaA#,ZhaoT#,ChenYG#,HuaG#.2023Standard:Humanintestinalcancerorganoids.CellRegeneration,12(1):24.doi:10.1186/s13619-023-00167-6.PMID:37378693(Editorial).[16]WangY,LinH,ZhaoL,HongF,HaoJ,ZhangZ,ShengW,S