第四章 酶的固定化

生物反應(yīng)工程姚璐曄第四章固定化酶講授內(nèi)容：什么是固定化酶制備固定化酶的依據(jù)固定化技術(shù)固定化酶的形狀和性質(zhì)固定化酶的應(yīng)用固定化細(xì)胞固定化酶動力學(xué)ImmobilizedEnzymeDefinitionTherestrictionofenzymemobilityina

fixedspace

isknownasenzymeimmobilization.Ingeneral,immobilizedenzymesareenzymesthatareattachedto,orentrappedwithin,amacro-scopic

supportmatrix

sothattheresultingcatalystcanbereused.固定化酶：是被固定在某一有限空間內(nèi)不再能自由流動而仍有催化活性的酶。TwooppositeconceptImmobilizedenzymeFreeenzyme優(yōu)點(diǎn)Advantages：不溶于水，易于與產(chǎn)物分離；可反復(fù)使用；可連續(xù)化生產(chǎn)；穩(wěn)定性好。缺點(diǎn)Disadvantages：

固定化過程中往往會引起酶的失活。制備固定化酶的依據(jù)(PrincipleofpreparingImmobilizedEnzyme)固定化酶必須能保持酶原有的專一性、高效催化能力和常溫、常壓下能起催化反應(yīng)等特點(diǎn)；固定化酶應(yīng)能回收、貯藏，利于反復(fù)使用；固定化酶應(yīng)用于機(jī)械化和自動化操作，所用載體常有一定的機(jī)械強(qiáng)度；固定化酶應(yīng)能保持甚至超過原有酶液的活性，即要保護(hù)活性中心基團(tuán)；固定化酶應(yīng)能最大程度與底物接近，從而提高產(chǎn)量，具有最小的空間位阻；固定化酶應(yīng)有最大的穩(wěn)定性；固定化酶應(yīng)易與產(chǎn)物分離。制備固定化酶的依據(jù)(PrincipleofpreparingImmobilizedEnzyme)ImmobilizedSolubleEnzymesMembrane-EntrappedBetweenMacroscopicMembranesMicro-Encapsulated共價結(jié)合Covalently-BoundToSupportToEnzyme包埋法吸附結(jié)合吸附法Adsorbed(PhysicalorIonic)Matrix-Entrapped固定化技術(shù)包埋法（Entrapment）

將酶包埋在凝膠的微小空格內(nèi)或埋于半透膜的微型膠束內(nèi)，但底物仍能滲入到里面與酶接觸。

優(yōu)點(diǎn)：利用此法制得的固定化酶，由于酶分子僅僅是被包埋起來，而未受到化學(xué)作用。酶蛋白幾乎不起變化，可適用于多種不溶酶的制備。Whenimmobilizedinapolymermatrix,enzymesolutionis

mixed

withpolymersolution

before

polymerizationtakesplace.The

physicalenclosure

ofenzymesinasmallspace.缺點(diǎn)：酶被包埋在內(nèi)部，對大分子底物很難發(fā)生催化作用。所以用包埋法制備的酶，一般只適用于小分子底物。包埋法又分為：微膠囊包埋法,膠格包埋法

Inallcases,asemi-permeablemembrane isusedtoretain

high-MW

compounds(enzyme)whileallowing

small-MW

compounds(substratesorproducts)accesstotheenzyme.Microencapsulation:aspecialformofmem-braneentrapment.微膠囊包埋法

將酶包埋在半透性聚合體膜內(nèi)，形成的直徑為1~100um。例如，天冬氨酸酶（asparaginase)就是用這種方法作成微膠囊。膠格包埋法首先被采用的膠格包埋法是：固定化胰蛋白酶木瓜蛋白酶

－淀粉酶Enzyme+N,N-甲叉雙丙稀酰胺,丙稀酰胺Ploymericmaterials:Ca-alginate（海藻酸鈣）,?-carrageenin（角叉菜膠

）,

polyacrylamide,collagen(卡拉膠);Solidmatrices:activatedcarbon,（多孔陶瓷）,diatomaceousearth（

硅藻土）.MatrixentrapmentMatricesusedforenzymeimmobilizationareusually:MembraneentrapmentMembrane:nylon,cellulose,polysulfone(聚砜),polyacrylate（聚丙烯酸鹽）.吸附法(Adsorption)酶被吸附于惰性的固相載體或離子交換劑。根據(jù)酶分子與載體吸附的性質(zhì)有物理吸附和離子吸附之別。AdsorptionAphysicalattachmentofenzymeonthesurfacesofsupportparticlesbyweakphysicalforces:

vanderWaals.物理吸附法(Physical

adsorption)

使用對酶蛋白有高度吸附能力的硅膠、活性炭，氧化鋁、高嶺土、石英沙、火棉膠、多孔玻璃等在一定條件下與水溶酶作用制得。

這些具有吸附能力的物質(zhì)就叫做載體。優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，反應(yīng)條件溫和，酶活力損失少，載體可反復(fù)使用。缺點(diǎn)：易引起蛋白質(zhì)表面變性，且由于結(jié)合力弱，當(dāng)反應(yīng)液的pH值、離子強(qiáng)度、溫度、底物濃度等發(fā)生變化時，會導(dǎo)致酶易從載體上部分或全部脫落。物理吸附法(Physical

adsorption)離子結(jié)合法(Ionicadsorption)

利用含有離子交換基團(tuán)的固相載體（如具有交換基團(tuán)的葡聚糖凝膠或纖維素）與酶蛋白分子的帶電基團(tuán)互相吸引（靠離子鏈）而形成絡(luò)合物。優(yōu)點(diǎn)：制作簡單，處理?xiàng)l件緩和，酶蛋白的活性中心和高級結(jié)構(gòu)破壞較少，可以制得活力較高的固定化酶。缺點(diǎn)：離子鍵結(jié)合較松散，如在高離子強(qiáng)度下進(jìn)行反應(yīng)時，酶與載體易分開。離子結(jié)合法(Ionicadsorption)第一個離子結(jié)合法固定化酶：

DEAE—Cellulose

固定化過氧化氫酶第一個工業(yè)化的固定化酶：

DEAE-SephadexA-50

固定化氨基?；?/p>

交聯(lián)法（Cross-Linking）

依靠雙功能基團(tuán)的試劑，使酶蛋白分子之間發(fā)生交聯(lián)，凝集成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)而成為固定化酶，最常用的雙功能試劑有戊二醛、順丁稀二酸酐和乙烯共聚物等。那么酶蛋白中的游離氨基、酚基、咪唑基及巰基均可參與交聯(lián)反應(yīng)。Theenzymemoleculescanalso

cross-link

witheachother.Butthismaycause

significant

changesintheactivesiteofenzymes,andalso

severe

diffusionlimitationsmayresult.使用戊二醛的酶固定化的交聯(lián)方式：雙功能試劑：常用的是戊二醛

O

OH—C—CH2—CH2—

CH2—

C—H共價結(jié)合法(CovalentBinding)

酶蛋白的非必需基團(tuán)通過共價鍵和載體形成不可逆的連接。一般在溫和條件下能參與偶聯(lián)的蛋白質(zhì)基團(tuán)包括：游離羧基（包括肽鏈C-末端的α-羧基等）、游離氨基（如肽鏈N-末端的α-氨基）等。Itistheretentionofenzymesonsupportsurfacesby

covalentbond

formation,via

certainfunctionalgroups,suchasamino,carboxyl,hydroxyl,and–SHgroup.

Thefunctionalgroups

mustnot

betheactivesites.共價結(jié)合法要注意兩個問題：①參加載體共價結(jié)合應(yīng)不是活性中心基團(tuán)，也不是參與酶蛋白的高級結(jié)構(gòu)的必需基團(tuán)，否則會使固定化酶不呈現(xiàn)出酶活力。②載體必須具有在溫和條件下可與酶蛋白發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)的基團(tuán)，又有一定的機(jī)械強(qiáng)度和較大的表面積。優(yōu)點(diǎn)：此法制得的固定化酶，酶分子和載體間的共價鍵較牢固，在介質(zhì)組成發(fā)生改變和進(jìn)行反應(yīng)時，都不會造成酶的脫落，因而可以反復(fù)使用。缺點(diǎn)：制取固定酶較復(fù)雜，反應(yīng)條件比較劇烈，所以要制得酶活力很高的固定化酶較為困難。制作方法：有重氮化法、烷基化和芳基化法、肽法和戊二醛法等。圖酶分子之間共價交聯(lián)和與水不溶性載體共價結(jié)合酶分子；(a）酶分子之間用雙功能基團(tuán)的化學(xué)交聯(lián)試劑相互交聯(lián)成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被結(jié)合到水不溶性載體上形成水不溶性的固定化酶SUMMARYThemostsuitablesupportmaterialandimmobilizationmethod

vary

dependingontheenzymeandparticularapplication.Thenhowtoselect

supportmaterials?Bindingcapacity,whichisafunctionofchargedensity,functionalgroups,porosity,andhydrophobicity;Stabilityandretentionoftheenzymeactivity,

whichisafunctionofgroupsonsupportmaterialandmicroenvironmentalconditions.Table:ComparisonoftheCharacteristicsofDifferentMethodsofEnzymeImmobilizationCharacteristicCarrierBindingMethodsCross-linkingMethod共價交聯(lián)EntrappingMethod包埋Physicaladsorption物理吸附IonicBinding離子吸附

CovalentBinding共價結(jié)合PreparationEasyEasyDifficultDifficultDifficultEnzymeActivityLowHighHighModerateHighSubstrateSpecificityUnchangeableUnchangeableChangeableChangeableUnchangeableBindingForceWeakModerateStrongStrongStrongRegenerationPossiblePossibleImpossibleImpossibleImpossibleGeneralApplicationLowModerateModerateLowHighCostofImmobilizationLowLowHighModerateLow固定化酶的形狀和性質(zhì)

(Properties

ImmobilizedEnzyme)1.

固定化酶的形狀顆粒、線條、薄膜和酶管等。顆粒占主要，主要用于工業(yè)生產(chǎn)，薄膜主要用于酶電極。2.固定化酶的性質(zhì)酶活力（下降），穩(wěn)定性（提高），酶學(xué)特征（與游離酶有所不同）

固定化酶的應(yīng)用(Applicationof

ImmobilizedEnzyme)1、使用酶柱式固定化酶連續(xù)催化反應(yīng)乙酰-DL—AlaL—Ala+乙酸乙酰-D—AlaAminoacylase

氨基酰化酶可以使生產(chǎn)過程連續(xù)化，其次它還可以使生產(chǎn)過程自動化，降低勞動強(qiáng)度，又提高生產(chǎn)效率，使成本大大降低。泵儲罐反應(yīng)產(chǎn)物離心機(jī)消旋反應(yīng)器固定化酶柱子晶體L-AlaL-AlaA-D-AlaA-L-AlaA-D-Ala2、固定化多酶反應(yīng)生化代謝產(chǎn)物，需由多種酶經(jīng)多步酶促反應(yīng)才能合成。多酶反應(yīng)器，為制造那些在有機(jī)合成上很棘手的，結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生化代謝物開辟了一條新的途徑。固定化酶的多酶反應(yīng)器分解葡萄糖示意圖3、固定化酶在分離提純上的應(yīng)用生物體內(nèi)的生物高分子和小分子配基之間（如酶蛋白分子與輔酶之間，酶蛋白分子與抑制劑分子之間，抗體分子和抗原分子之間等）都有一定的親和力，從而能形成絡(luò)合物，這些絡(luò)合物也能在一定的條件分離。利用這種性質(zhì)，把構(gòu)成絡(luò)合雙方的任何一方加以固定化，并裝成層析柱，就能從溶液中專一地分離提純構(gòu)成絡(luò)合物的另一成分。又固定化酶發(fā)展起來的分離技術(shù)統(tǒng)稱為親和層析技術(shù)。固定化細(xì)胞(Immobilizedcells)

直接把微生物細(xì)胞固定化。（1）固定化細(xì)胞的依據(jù)①廣義上講微生物細(xì)胞所具有的酶系相當(dāng)于被一層層具有選擇透過性的細(xì)胞膜和質(zhì)膜所包埋，這些酶本身就是固定化酶。②設(shè)法除去細(xì)胞特有的對細(xì)胞本身起自溶作用的酶系統(tǒng)，并防止外來細(xì)胞對它的侵襲，就能使此細(xì)胞反復(fù)使用。（1）固定化細(xì)胞的依據(jù)③細(xì)胞膜具有選擇性，它往往阻止人們因生產(chǎn)某種產(chǎn)品所加特定底物的進(jìn)入，這是細(xì)胞固定化要考慮的問題。④微生物細(xì)胞具有維持其生命活動的完整的酶系統(tǒng)，在制備固定化菌體細(xì)胞的過程中應(yīng)盡可能完整地保持細(xì)胞的這種特定狀態(tài)。（2）制備固定化細(xì)胞的方法

已經(jīng)使用的固定化方法種類繁多，千變?nèi)f化，新的方法也不斷涌現(xiàn)。一般認(rèn)為，理想的固定化細(xì)胞的制備方法，應(yīng)該具有如下特點(diǎn)：

1）應(yīng)該能夠控制固定化細(xì)胞的大小和孔隙度；

2）固定化所使用的原料應(yīng)該便宜、易得，固定化成本盡量低；

3)固定化方法簡單、易行，固定化過程應(yīng)盡可能溫和，盡量少損傷細(xì)胞；4)固定化細(xì)胞應(yīng)具有穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在所使用的pH值和溫度下，不會被破壞；

5)固定化細(xì)胞應(yīng)具有良好的機(jī)械穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性；6)載體對細(xì)胞應(yīng)該是惰性的，即不損傷細(xì)胞；7)固定化細(xì)胞應(yīng)該使底物、產(chǎn)物和其他代謝產(chǎn)物能自由擴(kuò)散；8)單位體積的固定化細(xì)胞應(yīng)該擁有盡可能多的細(xì)胞。（3）固定化細(xì)胞的性質(zhì)與固定化酶和游離的細(xì)胞比較a.既不把酶從微生物抽提出來，也不對其進(jìn)行提純處理；b.固定化細(xì)胞可以消除酶所固有的不穩(wěn)定性帶來的困難；c.使用固定化細(xì)胞，可獲得較高的酶穩(wěn)定性；d.使用固定化細(xì)胞，有利于反應(yīng)的連續(xù)化；e.當(dāng)產(chǎn)物的生物合成并非與菌體生長有關(guān)時（如抗生素發(fā)酵），只要提供所要產(chǎn)物必需的前提物質(zhì)（4）固定化細(xì)胞的生理學(xué)特性

固定化細(xì)胞的一個最明顯和最重要的生理學(xué)特性，是細(xì)胞的生理狀態(tài)，即是否具有生理活力。如圖所示：適用于多酶反應(yīng)，特別是需要輔酶的反應(yīng)適用于一種酶催化的反應(yīng)用于由一種輔酶或少數(shù)幾種酶催化的反應(yīng)（5）固定化細(xì)胞的應(yīng)用生產(chǎn)L-氨基酸、L-蘋果酸生產(chǎn)果葡糖漿生產(chǎn)6-APA和抗生素生產(chǎn)淀粉酶ImmobilizedEnzymeKineticsBioreactorkineticsIntrinsickinetics(本征反應(yīng)動力學(xué))MasstransferofsubstrateandproductIllustrationofMassTransportandChemicalReactionInteractionsinaSymmetricSlabofImmobilizedEnzyme.PHENOMENAPARAMETERSBulkFluidStagnantFilmorBoundaryLayerImmobilizedEnzymeSlabSurfaceofimmobilizedenzymeBulksolutionMasstransfercoefficient(kS,kP)Effectivediffusioncoefficient(DES,DEP)CONCENTRATIONPROFILECatalystthickness2LSubstratediffusionintopermeablecatalystDiffusionEffectsinSurface-BoundEnzymesonNonporousSupportMaterialsNon-porousSolidSupportFilmthicknessThefluxmass-transferrateJS

(mol/L·s)ofthesubstratefromthebulkfluidtotheinterface,Atsteadystate,thesubstratecannotaccumulateatthecatalystinterface,DefinetheDamkohlernumber:[Ss]