轉(zhuǎn)錄組系列講座04轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在代謝類疾病研究中的應(yīng)用

?轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在代謝類疾病研究中的應(yīng)用解螺旋

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知識金牌解

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醫(yī)

生

科

研

成

長知

識

金

牌01020304轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)簡介轉(zhuǎn)錄組學(xué)在代謝類疾病中的應(yīng)用方案設(shè)計與數(shù)據(jù)挖掘取樣保存注意事項CONTENTS課

程

目

錄轉(zhuǎn)錄組測序簡介01知

識

金

牌DNAProtein蛋白質(zhì)Translation翻譯Transcription轉(zhuǎn)錄Reverse

Transcription逆轉(zhuǎn)錄RNA中心法則的中心一環(huán)！解

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長轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)轉(zhuǎn)錄組測序簡介知

識

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牌轉(zhuǎn)錄組測序簡介解

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牌約2.5-3.5萬個基因；約10萬個不同的蛋白。約3萬個基因?約1.5萬個基因解

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長轉(zhuǎn)錄組測序簡介轉(zhuǎn)錄組測序簡介 知

識

金

牌轉(zhuǎn)錄組：特定細胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和，包括mRNA和非編碼RNA（廣義）。時間：某一時期、某一功能狀態(tài)等空間：特定組織、器官等轉(zhuǎn)錄組測序：通過新一代高通量測序，全面快速地獲得某一物種特定組織或器官在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本序列信息。特點：研究表達的基因/轉(zhuǎn)錄本解

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長知

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金

牌轉(zhuǎn)錄組測序簡介轉(zhuǎn)錄調(diào)控解

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長知

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牌轉(zhuǎn)錄組測序簡介樣品采集RNA抽提質(zhì)檢Illumina

HiSeq測序生信分析+數(shù)據(jù)挖掘如何真正實現(xiàn)數(shù)據(jù)挖掘?解

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長知

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牌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn)大規(guī)模功能基因(de

novo)挖掘新基因、新轉(zhuǎn)錄本（有參轉(zhuǎn)錄組）研究基因/轉(zhuǎn)錄本的表達、差異及功能發(fā)現(xiàn)特定組織或者條件下的可變剪切形式SNP檢測與分析ncRNA的鑒定及靶基因預(yù)測轉(zhuǎn)錄組測序簡介RNA-seq解

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長生理調(diào)控生長發(fā)育免疫應(yīng)答致病機制藥物效應(yīng)分子標記轉(zhuǎn)錄組學(xué)在代謝類疾病中的應(yīng)用02知

識

金

牌1.代謝疾病發(fā)生發(fā)展的機制研究：通過轉(zhuǎn)錄組測序可以獲得疾病，尤其是并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展過程中，相關(guān)基因mRNA和非編碼RNA的結(jié)構(gòu)變異、表達差異情況和特異性表達情況，研究疾病發(fā)生和發(fā)展的分子機制，鑒定biomarker，協(xié)助疾病診斷、疾病監(jiān)控和治療以及藥物靶點研究、藥物開發(fā)等。/10.1016/j.celrep.2017.12.071解

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長知

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牌2.代謝疾病的干預(yù)研究：通過轉(zhuǎn)錄組測序可以研究不同類型、不同劑量、不同處理時間等條件下，藥物或其他處理對機體作用情況及其內(nèi)在的作用機理。通過mRNA和非編碼RNA的基因差異表達和功能注釋、富集情況，可以研究檢測外源處理對基因表達的影響情況，從而了解影響機體代謝和生理病理的調(diào)控機制。/10.1016/j.celrep.2015.10.069解

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長解

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長知

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牌DOI

10.1186/s12864-016-3199-8研究背景：糖尿病腎?。―N）是1型和2型糖尿病的主要并發(fā)癥，

從轉(zhuǎn)錄層面了解糖尿病如何調(diào)節(jié)DN的發(fā)生發(fā)展，對于理解疾病的生物學(xué)機制和新治療手段的發(fā)展具有現(xiàn)實意義。實驗設(shè)計：野生型（WT），模型組（DN），早期治療（ET,

Early

Treatment）和晚期治療組（(LT,

late

treatment）。注：使用P78

peptide進行治療WT

n=13Diabeticn=7ETn=8LTn=7Kidney

tissuesRNA-seq文獻案例1知

識

金

牌14316

RNA

transcripts

FPKM

≥1；Nhej1,Ept1,Cyp4a14andUgt1a2,

whicharesignificantlyregulatedbydiabetes

and

treatment

.解

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長知

識金

牌965164133183Asmallsetofgeneswherethechangesin

diabetesweresubstantially(~50%)or

completely

reversed

byP78treatment.解

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牌associated

with

the

disease

or

other

pathologies解

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長線粒體功能障礙、Nrf-2介導(dǎo)的氧化應(yīng)激和腎損傷是DN的關(guān)鍵機制知

識

金

牌研究綜述：胰島細胞對維持正常的血糖水平至關(guān)重要，其功能障礙是糖尿病發(fā)展的基礎(chǔ)。本研究通過單細胞RNA測序技術(shù)檢測非糖尿病和2-型糖尿病人類胰腺a、b、d和PP細胞的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)了若干細胞類型特異性基因和通路，其中92%的基因之前并沒有報道過與胰島細胞功能或生長相關(guān)。解

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成

長D/10.1016/j.cmet.2016.08.018文獻案例212

non-diabeticand

6T2Dorgandonors.解

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長知

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牌Thecellssegregatedinto

distinctbuthomogeneous

populationsindependentof

donor

type.知

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牌The

enriched

geneswere

similar

between

donor

types；解

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長The

sensing

and

metabolism

of

glucoseThe

expression

of abundant

geneswere

onlymarginally

affected

by

T2D.知

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金

牌28.2%

have

no

known

function；2.4%

are

known

to

regulate

islet

cell

growth；6.1%to

modulate

islet

cellfunction；37.6%

non-islet

cell

growth；25.7%

not-islet

cell

function.解

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牌Some

cell-type

enriched

genes

showed

notable

species

differences.解

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長0.080.16方案設(shè)計與數(shù)據(jù)挖掘03實驗處理差異：不同處理方式：藥物、飲食、生活環(huán)境等；不同處理梯度：濃度、劑量、處理時間等；不同組織器官：心、腦、肝等。樣本選擇樣本的代表性：模型生長狀態(tài)、生理指標特征等；樣本的一致性：取材時間、部位、處理條件等方面保持一致；取樣的準確性：組織取材部位要準確，剔除無關(guān)組織部位；取樣的及時性：從采集到制備的過程中盡可能地做到迅速。解

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牌方案設(shè)計要點解

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牌生物學(xué)重復(fù)的意義減少組內(nèi)個體差異的干擾，體現(xiàn)真實的組間差異；評估差異表達基因的可靠性；生物學(xué)重復(fù)的相關(guān)性可以輔助篩查異常的樣本；檢驗生物學(xué)實驗操作的可重復(fù)性；如不設(shè)生物學(xué)重復(fù)，部分雜志可能會因此拒稿。Doi:org/10.1186/s13059-016-0881-8方案設(shè)計要點知

識

金

牌1.區(qū)分生物學(xué)重復(fù)與技術(shù)重復(fù)生物學(xué)重復(fù)：指樣本重復(fù)，比如5只小鼠個體，同時做一種處理，就是5個生物學(xué)重復(fù)；技術(shù)重復(fù)：一般是三次實驗，比如對同一份組織樣本，提了三次RNA，做三次real

time。解

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長方案設(shè)計要點數(shù)據(jù)挖掘思路 知

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牌NO.1：表達量差異角度表達量差異分析→

功能注釋與富集→

表達量→

鎖定目標基因→

實驗驗證NO.2：功能角度功能查詢

→ 表達量差異→表達量 →

鎖定目標基因

→

實驗驗證NO.3：表達量角度表達量統(tǒng)計

→ 功能注釋與富集（→

表達量差異）→鎖定目標基因

→實驗驗證研究目標：明確---有目標的基因或者目標的通路不明確---希望通過轉(zhuǎn)錄組分析找到目標基因，以便揭示作用 分子機制解

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牌NO.1：表達量差異角度（模擬：對三個比較組中共有的差異基因進行分析）組內(nèi)：可選擇關(guān)注

up的或down的差異基因步驟1：

確定要研究的表達量差異基因組間：差異基因（不區(qū)分up,down）在不同比較組間的

的分布情況，選擇共有或者特有的比較組內(nèi)：表達量差異分析→

表達差異詳情表→“篩選表格”→創(chuàng)建基因集比較組間：基因集Venn

分析→

選擇共有或特有基因集→創(chuàng)建基因集解

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長數(shù)據(jù)挖掘思路知

識

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牌步驟2：

對差異基因進行功能注釋與富集，獲得與研究背景相關(guān)的基因基因集分析模塊→

功能注釋分析（COG,

GO,KEGG）

→功能富集分析（GO,

KEGG）→選擇與研究背景相關(guān)通路或GO

Term

→

縮小目標基因確定范圍→創(chuàng)建基因集步驟3：表達量→

鎖定目標基因→

實驗驗證表達量分析模塊→

篩選表格

→

顯示基因集→鎖定目標基因→

實驗驗證解

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長數(shù)據(jù)挖掘思路解螺

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牌NO.2：功能角度（模擬：對信號通路（signaling

pathway)進行分析）步驟1：

根據(jù)功能注釋篩選具有該功能的基因功能查詢模塊

→

鍵入關(guān)鍵詞進行檢索

→

創(chuàng)建基因集數(shù)據(jù)挖掘思路知

識

金

牌步驟2：

分析其在比較組別中的差異情況，篩選出表達差異的基因表達量差異分析模塊

→

表達差異詳情表

→篩選表格

→

創(chuàng)建基因集步驟3：表達量→

鎖定目標基因→

實驗驗證表達量分析模塊→

篩選表格

→

顯示基因集→鎖定目標基因→

實驗驗證解

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長數(shù)據(jù)挖掘思路解

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牌NO.3：表達量角度（模擬：篩選在A,B組中表達在C組中不表達的基因）步驟1：

在表達量分析模塊篩選符合要求的基因表達量分析模塊

→

表達量矩陣

→篩選表格

→

創(chuàng)建基因集步驟2：

在表達量分析模塊篩選符合要求的基因基因集分析模塊

→ 功能注釋與富集→選擇與研究背景相關(guān)通路或GO

Term→獲得目標基因數(shù)據(jù)挖掘思路解

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牌取樣保存注意事項04知

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牌取樣保存注意事項1.

實驗工具和環(huán)境 去除內(nèi)源性/外源性RNase實驗人員須穿好實驗服，戴上手套和口罩，所用到的耗材和器皿以及實驗區(qū)域要在RNA提取前進行RNase清除（高溫干熱/濕熱滅酶、使用

RNA

酶抑制劑）處理。研缽剪刀 鑷子手術(shù)刀 托盤EP管槍頭解

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牌取樣保存注意事項RNAlater 4℃過夜，-20℃或-80℃長期保存液氮速凍，-80℃保存010203

細胞加入裂解液反復(fù)吹打至裂解充分，液氮速凍-80℃保存解

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牌取樣保存注意事項組織取樣（建議送樣量

≥

1g）無酶凍存管，液氮中預(yù)冷；活體上迅速取下組織（切成黃豆粒大小的塊狀）；RNase-free水配制1xPBS或生理鹽水快速清洗組織表面的污漬，吸干表面液體后收集進凍存管（管的下部分保持在液氮中）；液氮速凍；-80℃保存或干冰運送，避免反復(fù)凍融；樣本注意分裝和備份干冰或低溫冰箱的降溫速度較緩慢，不能及時抑制RNase的活性而引起樣本降解，因此需在最短時間內(nèi)將樣本轉(zhuǎn)移至液氮中保存，徹底冷凍后再轉(zhuǎn)移到-80℃

。解

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牌取樣保存注意事項組織取樣（建議送樣量

≥

1g）將新鮮組織切割成規(guī)定的大小，按比例加入RNA

later中；將樣本置于4°C保存過夜（使RNAlater完全滲透組織）

；轉(zhuǎn)移至-20℃或

-80℃長期保存；為避免組織塊在運輸?shù)倪^程中露出液面，應(yīng)將RNAlater灌滿管子。僅適用于新鮮組織樣本，不適用已冷凍保存的組織樣本

、骨頭等。不建議用RNA

later保存液體樣本（RNA

later會與液體樣本發(fā)生互溶）。解

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牌取樣保存注意事項細胞樣本采集（建議送樣量：>細胞數(shù)5X106

）貼壁細胞的處理：取生長狀態(tài)良好（對數(shù)生長期）細胞，確定細胞數(shù)量；用1X

PBS洗滌細胞，離心棄PBS，洗1-2次；加入適量裂解液反復(fù)吹打至裂解充分；轉(zhuǎn)移至離心管中，-80℃保存；懸浮細胞的處理：取生長狀態(tài)良好的細胞懸液，確定細胞數(shù)量；離心，吸除細胞培養(yǎng)基，1XPBS洗滌，離心棄PBS，洗1-2次；加入適量裂解液反復(fù)吹打至裂解充分；轉(zhuǎn)移至離心管中，-80℃保存；按每10

cm2

（相當于六孔板一個孔或35mm直徑培養(yǎng)皿）細胞加1mLTRIzol

試劑的比例解

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長按照每5×106

個細胞加1

mL

TRIzol的比例知

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牌取樣保存注意事項解

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長細胞樣本采集（建議送樣量：>細胞數(shù)5X106

）注意事項：細胞必須裂解充分后再寄送，勿將凍干的細胞直接寄送；細胞樣品胰酶消化要注意把握消化程度，胰酶會消化細胞膜上的膜蛋白，導(dǎo)致細胞破裂，破裂的細胞會釋放RNase導(dǎo)致RNA降解；對于1-1000個細胞（微量樣本），須保存在專門的細胞裂解液中，應(yīng)標明細胞數(shù)量（跟PCR實驗循環(huán)數(shù)相關(guān)）知

識

金

牌取樣保存注意事項血液樣本采集（建議送樣量：≥2ml

）使用抗凝采血管（不建議使用肝素抗凝管）采集全血；采血后輕輕倒轉(zhuǎn)采血管混合4-5

次，使抗凝劑與血液混勻；快速轉(zhuǎn)移至單獨的凍存管中，按照1ml/管分裝，加5ml(即5倍體積)Trizol/Trizol

LS，混勻；液氮速凍后，放-80℃冰箱保存；注意事項：每個環(huán)節(jié)盡可能的快速完成，避免RNA的降解。臍帶血采集，請具體咨詢技術(shù)同事。解

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長知

識

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牌取樣保存注意事項血清/血漿樣本采集（建議送樣量：250μl/管，3管）血漿使用抗凝采血管（不建議使用肝素抗凝管）采集全血；采血后輕輕倒轉(zhuǎn)采血管混合4-5次，使抗凝劑與血液混勻；直立置于4℃待血液完全凝固，離心，分離血漿；液氮速凍后，放-80℃冰箱保存?？鼓齽┩扑]：EDTA、檸檬酸鈉解

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牌取樣保存注意事項血清/血漿樣本采集（建議送樣量：250μl/管，3管

）血清采集全血（不加抗凝劑）；直立置于4℃待血液完全凝固，離心，分離血清；液氮速凍后，放-80℃冰箱保存。注意事項：血清分離時，盡可能的避免溶血反應(yīng)。血清/血漿送樣量的原則：越多越好。解

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牌取樣保存注意事項外泌體樣本采集客戶捕獲的外泌體提供外泌體沉淀體積

＞15μl/管，每個樣本提供4管；可直接-80℃保存，也可以用100μl

無酶水或100μl

PBS（細胞級）或1ml

Trizol重懸，再-80℃保存。RNATotal

RNA>2ng，濃度>0.2ng/μl，體積>5μlTotal