基因治療(生物化學)省公開課一等獎全國示范課微課金獎

基因治療基因治療（genetherapy）是向靶細胞導入外源基因，以糾正或賠償基因缺點，到達治療遺傳病目標。人類遺傳疾病5000各種，基本上不可能用常規(guī)方法治療。個別病例只能對癥療法，減輕癥狀，不能治愈。基因治療可能是唯一方法。1990年美國重組DNA咨詢委員會同意治療腺苷脫氨酶（ADA）臨床治療方案，2個病例癥狀改進。1991年復旦大學與二軍大學合作用基因療法治療血友病B，患者癥狀有所改進1第1頁一、基因治療類型

1.基因調控治療從基因水平調控缺點基因表示，改進癥狀鐮型細胞貧血癥---用5-氮胞苷抑制甲基化酶，使因甲基化而關閉γ基因重新開放，產生HbF代替HbA用反義RNA抑制基因表示核酶（ribozyme）切割RNA阻斷基因表示腫瘤治療，在基因水平抑制腫瘤細胞基因惡性表示和引導腫瘤細胞逆轉。2第2頁基因治療類型（續(xù)）2.基因矯正治療

基因增補—正?；驅牖颊唧w內賠償缺點基因功效基因替換—以正?；蛉〈儺惢蚧蛐Ｕw外對異?；蜻M行糾正。3第3頁基因治療類型（續(xù)）按矯正基因類型分為兩種基因治療：

·生殖細胞基因治療—對生殖細胞或早期胚胎細胞進行基因矯正。

·體細胞基因治療—以體細胞為受體細胞，不影響下一代慣用細胞介導法：選擇靶細胞在體外進行基因修飾，再將其輸入體內。4第4頁基因置換（genereplacement）

定義：將特定目標基因導入特定細胞，經過定位重組，導入正常基因，以置換基因組內原有缺點基因。

目標：將缺點基因異常序列進行橋正。對缺點基因缺點部位進行準確原位修復，不包括基因組任何改變。5第5頁定向整合條件:轉導基因載體與基因組DNA含有相同序列。帶有目標基因載體就能找到同源重組位點，進行部分基因序列交換?；蛲粗亟M技術又稱為基因打靶(genetargeting）細胞內基因同源重組發(fā)生率很低?；蛲粗亟M技術6第6頁基因增補（geneaugmentation）

定義:經過導入外源基因使靶細胞表示其本身不表示基因。類型:有缺點基因細胞中導入正?；?，而細胞內缺點基因并未除去，經過導入正常基因表示產物，賠償缺點基因功效；向靶細胞中導入靶細胞原來不表示基因，利用其表示產物到達治療疾病目標。7第7頁基因干預（geneinterference）基因失活

定義：采取特定方式抑制某個基因表示，或者經過破壞某個基因結構而使之不能表示，以到達治療疾病目標。8第8頁（一）反義RNA（antisenseRNA）

1.反義RNA與基因表示調控利用反義RNA對體外培養(yǎng)細胞進行基因表示調控，通常采取方法有兩種：

（1）體外合成反義RNA，直接作用于培養(yǎng)細胞，細胞吸收RNA后，發(fā)揮作用。（2）構建一些能轉錄反義RNA重組質粒，將這些質粒轉入細胞中，轉錄出反義RNA而發(fā)揮作用。9第9頁反義RNA技轉移術①受體介導RNA轉移十分專一，而且效率高；②被轉移RNA是被保護，與周圍環(huán)境之間存在多聚賴氨酸保護層,能夠抵抗環(huán)境中核酸酶降解作用。借助前述受體介導基因轉移方法，能夠實現受體介導反義RNA轉移。10第10頁反義RNA優(yōu)點

受體介導反義RNA基因治療有其本身優(yōu)點，而在一定程度上補充了轉基因治療不足。

（l）安全性高（2）反義RNA設計和制備方便

（3）含有劑量調整效應

（4）能直接作用于一些RNA病毒11第11頁核酶(ribozyme)

天然核酶多為單一RNA分子，含有自我剪切作用。但核酶也能夠由兩個RNA分子組成。在基因治療時，利用核酶分子結合到靶RNA分子中適當部位，形成錘頭狀核酶結構，將靶RNA分子切斷，經過破壞靶RNA分子而到達治療疾病目標。

12第12頁核酶錘頭狀二級、三級結構只要兩個RNA分子經過互補序列相結合，形成錘頭狀二級結構（3個螺旋區(qū)），并能組成核酶關鍵序列（13個或11個保守核苷酸序列），就可在錘頭右上方產生剪切反應。目錄13第13頁1.核酶設計核酶是經過靶RNA分子與核酶分子共同組成酶活性結構域，要從靶分子和核酶分子兩個方面來設計核酶。

（1）選擇適當靶部位，該部位含有核酶切割位點，能與核酶分子結合并組成酶活性結構域。（2）核酶基本組成：用于基因治療核酶分子由三個部分組成，中間是保守序列（能夠組成酶活性結構域），兩端是引導序列。14第14頁干擾RNA

1.RNA干擾現象RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是一個由雙鏈RNA誘發(fā)基因緘默現象。在此過程中，與雙鏈RNA有同源序列信使RNA（mRNA）被降解，從而抑制該基因表示。有義RNA（senseRNA）或反義RNA（antisenseRNA）均能抑制線蟲基因表示，雙鏈RNA比單鏈RNA更為有效。這與傳統(tǒng)上對反義RNA技術解釋恰好相反。而且其抑制基因表示效率比反義RNA最少高2個數量級。

15第15頁2.RNA干擾機制

RNA干擾過程主要有2個步驟：

（1）小干擾性RNA（siRNA）（2）siRNA與細胞內一些酶和蛋白質形成復合體，稱為RNA誘導緘默復合體（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。16第16頁研究基因功效新工具

因為RNA干擾技術含有高度序列專一性和有效干擾能力，能夠使特定基因緘默或功效喪失，所以能夠作為功效基因組學一個強有力研究工具。

RNA干擾技術能夠在哺乳動物中抑制特定基因表示，建立各種表型；抑制基因表示時間能夠控制在發(fā)育任何階段。

17第17頁1.體外化學合成;2.用質粒載體或病毒載體可在細胞內穩(wěn)定地生成。siRNA產生18第18頁定義：將“自殺”基因導入宿主細胞中，這種基因編碼酶能使無毒性藥品前體轉化為細胞毒性代謝物，誘導靶細胞產生“自殺”效應，從而到達去除腫瘤細胞目標。應用：是惡性腫瘤基因治療主要方法。（四）自殺基因治療(SuicideGeneTherapy)19第19頁

（五）基因免疫調整經過將抗癌免疫增強細胞因子或MHC基因導入腫瘤組織，以增強腫瘤微環(huán)境中抗癌免疫反應。20第20頁二、基因治療條件

·對導入基因及其產物有詳盡了解；

·外源基因有效導入受體細胞、穩(wěn)定整合、適量表示；

·不影響受治細胞基因組及表示調控；

導入基因方法安全，載體對靶細胞無害；21第21頁三、基因治療標準對象是病情嚴重、預后差、別無他法患者轉移基因被克隆無需高水平表示和準確定量控制就有治療效果靶細胞獲取或回輸安全轉移基因表示對細胞微環(huán)境無嚴格特異性要求22第22頁四、基因療法步驟

目標（治療）基因選擇依據基因治療類型選擇對應目標基因（增補、替換、添加）基因載體構建使目標基因在受體細胞內高效、可控、穩(wěn)定地表示

受體細胞選擇易分離獲取，體外增殖存活，大量擴增。如成纖維細胞、淋巴細胞、骨髓造血干細胞23第23頁

基因轉移(genetransfer)方法

1.病毒介導基因轉移2.非病毒介導基因轉移24第24頁

1.病毒介導基因轉移系統(tǒng)病毒載體介導基因轉移效率較高據統(tǒng)計，有72%臨床試驗計劃和71%病例使用了病毒載體，其中用得最多是反轉錄病毒載體。25第25頁反轉錄病毒結構及生活周期（1）反轉錄病毒

26第26頁

（2）腺病毒(adenovirus)載體

經過受體介導內吞作用進入細胞內，然后腺病毒基因組轉移至細胞核內，保持在染色體外，不整合進入宿主細胞基因組中。腺病毒是人類呼吸道感染病原體，還未發(fā)覺與腫瘤發(fā)生相關聯(lián)。27第27頁慣用基因治療載體

整合致病性感染細胞克隆容量反轉錄病毒載體隨機整合，效率高可能致病分裂細胞<7kb腺病毒載體不整合，可能丟失不致病分裂細胞、非分裂細胞

腺相關病毒載體定點整合(19號染色體特定區(qū)域)不致病分裂細胞、非分裂細胞<5kb<7.5kb28第28頁2.非病毒載體介導基因轉移系統(tǒng)

（1）脂質體介導基因轉移技術使用方便、成本低廉?；驹?

利用陽離子脂質體單體與DNA混合后，可形成包埋外源DNA脂質體，然后與細胞一起孵育，即可經過細胞內吞作用將外源DNA（即目標基因）轉移至細胞內，并進行表示。

29第29頁（2）受體介導轉移技術

將DNA與細胞或組織親和性配體偶聯(lián)，可使DNA含有靶向性。這種偶聯(lián)通常經過多聚陽離子（如多聚賴氨酸）來實現。多聚陽離子與配體共價連接后，又經過電荷相互作用與帶負電荷DNA結合，將DNA包圍，只留下配體暴露于表面。這么形成復合物可被帶有特異性受體靶細胞吞飲，從而將外源DNA導入靶細胞。30第30頁

（3）基因直接注射技術

不需要進行基因工程繁瑣操作，直接將裸露DNA注入動物肌肉或一些器官組織內。動物試驗表明：接收注射外源DNA小鼠能夠按其基因編碼合成對應蛋白質，并能維持數月之久。

將促進心臟血管生長基因直接注入試驗鼠心臟，可使其心臟壁內毛細血管增加30%～40%；將胰島素基因直接注入鼠骨骼肌細胞，能分泌糖尿病所缺乏胰島素；肌內注射凝血因子Ⅸ基因，可產生血友病所需凝血因子Ⅸ。31第31頁

基因直接注射法優(yōu)點制備含有調控部件質粒DNA重組體技術較輕易；排除病毒載體可能潛在致癌性或其它副作用；導入基因不需整合即可表示，防止了反轉錄病毒載體導入整合后，一旦發(fā)生副作用不易中止或逆轉缺點；基因直接注射法可重復使用，而病毒載體則可能誘導體內免疫應答，致使重復治療效果下降。

32第32頁五、基因治療應用治療惡性腫瘤

治療黑色素瘤--將已導入IL2基因TIL細胞回輸給病人，開啟本身免疫治療艾滋病--用射線照射已導入HIV基因成纖維細胞，細胞停頓分化，但能產生gp160，將細胞回輸給病人，能激活免疫系統(tǒng)，殺傷HIV感染細胞。治療家族性高膽固醇血癥（FH）

肝細胞低密度脂蛋白（LDL）受體基因混亂造成，將LDL基因導入病人離體培養(yǎng)肝細