基因工程和蛋白質(zhì)工程（4大考點(diǎn)+10個(gè)易錯(cuò)點(diǎn)）-2025年高考生物一輪復(fù)習(xí)知識清單

知識清單37基因工程和蛋白質(zhì)工程

~~/01/~

知識導(dǎo)圖

原理：基因重組

限制性內(nèi)切核酸髀

工具

篩選目的基因

原理：DNA半保留復(fù)制

獲取目的基因「

技術(shù)

--------tPCR所需物質(zhì)：DNA模板；引物；脫氧核昔

酸；耐高溫的聚合前（酶）

基DNATaq

因目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并

工可遺傳給下一代，同時(shí)能夠表達(dá)和發(fā)揮作用

程

基因表達(dá)載體的構(gòu)建表達(dá)載體的組成：啟動子；目的基因；限制酶切

割位點(diǎn)；終止子；復(fù)制原點(diǎn)；標(biāo)記基因

過程

花粉管通道法

植物細(xì)胞

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

方法

動物細(xì)胞:顯微注射法

原核生物：感受態(tài)細(xì)胞法

基

通過PCR等技術(shù)檢測受體細(xì)胞DNA上是否

因

插入了目的基因，或是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA

工

分子水平

程目的基因的通過抗原一抗體雜交技術(shù)檢測目的基因是

否翻譯成相應(yīng)蛋白質(zhì)

和檢測與鑒定

蛋個(gè)體水平

白

農(nóng)牧業(yè)方面的應(yīng)用轉(zhuǎn)基因抗蟲植物：轉(zhuǎn)基因抗病植物：轉(zhuǎn)基因抗除草劑

質(zhì)植物；改良植物的品質(zhì)；提高動物的生長速率；改善

工畜產(chǎn)品的品質(zhì)

程應(yīng)用

醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用

生產(chǎn)細(xì)胞因子'抗體'疫苗和激素等；乳腺生物反應(yīng)器

食品工業(yè)方面的應(yīng)用

生產(chǎn)食品工業(yè)用髀、氨基酸和維生素等

原理：通過改造和合成基因，來改造現(xiàn)有蛋白質(zhì)，或制造一種新的蛋白質(zhì)

目的.改莖或合成氨基酸序列網(wǎng)L蛋自質(zhì)尊t預(yù)期功能

基本思路

蛋白質(zhì)工程基因—>mRNA—?多肽鏈----*（三維結(jié)構(gòu)）--->生物功能

轉(zhuǎn)業(yè)翻譯川登彳「使

應(yīng)用：研發(fā)速效胰島素類似物：研發(fā)藥物（如干擾素）片：改進(jìn)髀的性能或開發(fā)新

的工業(yè)用鯽

/02/

考點(diǎn)清單

考點(diǎn)1重組DNA技術(shù)的基本工具

1.基因工程的概念：基因工程是指按照人們的愿望，通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予

生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。從技術(shù)

操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫

作重組DNA技術(shù)。對基因工程概念的理解：

基因工程的別名基因剪切拼接技術(shù)、重組DNA技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)

操作環(huán)境主要在生物體外

操作對象基因(DNA)

操作水平DNA分子水平

基本程序剪切一■拼接一導(dǎo)入一表達(dá)

結(jié)果創(chuàng)造出人類需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品

原理基因重組

特點(diǎn)定向改造生物遺傳特性；徹底打破種間界限補(bǔ)充說明：

2.基因工程的基本工具質(zhì)粒作為載體的原

(1)限制性內(nèi)切核酸酶一“分子手術(shù)刀”：切割DNA分子的工具是限制性內(nèi)

因，質(zhì)粒DNA分子有

切核酸酶，又稱限制酶。

一個(gè)至多個(gè)限制酶切

①來源：主要是從原核生物中分離純化出來的。

割位點(diǎn)，供外源DNA

②作用特點(diǎn)：切割外源DNA,對自身的DNA不起作用，從而達(dá)到保護(hù)自身

片段插入其中；攜帶

的目的；專一性，能夠識別雙鏈DNA分子的特定核甘酸序列，并且使每一條鏈

中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。外源DNA片段的質(zhì)粒

③作用結(jié)果：經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式一黏性末進(jìn)入受體細(xì)胞后，能

端和平末端。

在細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)

(2)DNA連接酶——“分子縫合針”：將切下來的DNA片段拼接成新的DNA

制，或整合到受體

分子，依靠的是DNA連接酶。

DNA±,隨受體

①DNA連接酶的作用：連接兩個(gè)DNA片段的末端，拼接成新的DNA分子。

同步復(fù)制；質(zhì)粒

②DNA連接酶的種類和特點(diǎn)DNA

種類E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶上常有特殊的標(biāo)記基

來源大腸桿菌T4噬菌體因，便于重組DNA分

特點(diǎn)只能將雙鏈DNA片段既能連接雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端，也能

子的篩選；質(zhì)粒不影

互補(bǔ)的黏性末端連接起連接雙鏈DNA片段的平末端，但連接平末端的

響受體細(xì)胞正常的生

來效率相對較低

③作用實(shí)質(zhì)：DNA連接酶能將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復(fù)被限制酶切

開的磷酸二酯鍵。

（3）基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”：要將外源基因送入受體細(xì)

胞，還需要有運(yùn)輸工具，這就是“分子運(yùn)輸車”，又叫載體（或運(yùn)載體）。

①載體的作用：一是作為運(yùn)載工具，與外源基因（即目的基因）的DNA片段

結(jié)合，將目的基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中；二是在受體細(xì)胞內(nèi)對目的基因進(jìn)行大量的

復(fù)制。

②常用的載體：最常用的載體是質(zhì)粒。其他載體：噬菌體、動植物病毒等。

③需具備的條件

能在受體細(xì)胞中穩(wěn)定保存并復(fù)制。

具有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)，供外源DNA片段插入。

具有標(biāo)記基因，便于篩選含重組DNA分子的細(xì)胞。

對受體細(xì)胞無害，不影響受體細(xì)胞正常的生命活動。

3.DNA的粗提取與鑒定

（1）實(shí)驗(yàn)原理：利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面

的差異，提取DNA,去除其他成分。

①DNA的溶解性：DNA不溶于酒精，但是細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)溶于酒精（利

用這一原理，可初步分離DNA與蛋白質(zhì)）。DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃

度的NaCl溶液中溶解度不同（利用這一特點(diǎn)，選擇適當(dāng)濃度的NaCl溶液就能使

DNA充分溶解，從而使雜質(zhì)沉淀：或者讓其他成分溶解而使DNA析出，以達(dá)到

分離的目的）。

②DNA的鑒定原理：在沸水浴的條件下，DNA與二苯胺試劑反應(yīng)呈現(xiàn)藍(lán)色。

（2）實(shí)驗(yàn)步驟

[研磨材料1新鮮洋蔥,加爭亶_液充分研磨

濾液中可能含盾DNA、RNA

以及蛋白演、脂質(zhì)、糖類

過濾（紗布）、提取旗選;/笈在

獲取含DNA

—1500r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min,

的濾液

取上清液

"在上清液中加入體積分?jǐn)?shù)為字隊(duì)

,、的冷酒精溶液，靜置后用玻璃棒沿

[DNA的析出H一個(gè)方向攪拌卷起白色絲狀物,

或在10000r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min,

、取沉淀物

（I溶“解IPN、A，H）J將的N絲a狀Cl物溶或液沉中淀物溶解在2mol/L

在溶有DNA的溶液中加入二苯胺

[DNA的鑒定試劑，混合均勻后將試管在沸水中

加熱5min,溶液變成藍(lán)色

考點(diǎn)2基因工程的基本操作程序

1.目的基因的篩選與獲取

（1）目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因，如與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)

藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因。

（2）獲取目的基因的方法：從基因文庫中獲取目的基因；利用PCR獲得和擴(kuò)

增目的基因

（3）利用PCR獲得和擴(kuò)增目的基因

①含義：PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫。它是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留復(fù)制的

原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對目的基因的核甘酸

序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。需要具備的條件有模板、原料、引物、酶、控制溫度

等。

②原理：利用DNA半保留復(fù)制原理，在體外將目的基因的核昔酸序列不斷

地加以復(fù)制，使其數(shù)量成指數(shù)形式擴(kuò)增（約為21其中為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）。

③前提：有一段已知目的基因的核甘酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物。

@PCR的反應(yīng)及其作用

條件作用

在一定的緩沖液提供相對穩(wěn)定的pH環(huán)境；真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都

（含Mg2+）中進(jìn)行需要Mg2+激活

4種脫氧核昔酸作為合成DNA子鏈的原料

DNA母鏈作為DNA復(fù)制的模板

Taq酶（耐高溫）催化合成DNA子鏈

引物使T叫酶能夠從引物的3,端開始連接脫氧核甘酸

溫度90℃以上變性：使DNA片段雙鏈解開

控制50℃左右復(fù)性：使解開的兩條DNA單鏈分別與相應(yīng)的引物結(jié)合(退火)

72℃左右延伸：T叫酶催化子鏈合成

⑤擴(kuò)增的過程:

第一步：將反應(yīng)體系(包括雙鏈模板、引物、Q4酶、4種脫氧核甘酸以及酶

促反應(yīng)所需的離子等)加熱至90℃以上，使雙鏈DNA兩條鏈之間的氫鍵打開，

變成單鏈，分別作為聚合反應(yīng)的模板。

第二步：將反應(yīng)體系降溫至50℃左右，使引物分別與模板DNA鏈31端的相

應(yīng)序列互補(bǔ)配對，這個(gè)過程稱為復(fù)性。

第三步：將反應(yīng)體系升溫至72℃左右，在hq酶的催化作用下，將與模板

DNA互補(bǔ)的單個(gè)核甘酸加到引物所提供的3，一OH上，使DNA鏈延伸，產(chǎn)生一

條與模板鏈互補(bǔ)的單鏈DNA。

2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建

(1)基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的核心。其中心內(nèi)容是使目的基因與運(yùn)注意說明：

載體結(jié)合，形成重組運(yùn)載體，最后通過重組運(yùn)載體將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞。

為了防止載體或目的

(2)構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以

基因的黏性末端自己

遺傳給下一代，同時(shí)，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。

連接即所謂“環(huán)化”，可

(3)基因表達(dá)載體的組成及其作用

限制酶切割位點(diǎn)用不同的限制酶分別

啟動子\/終止子處理含目的基因的

DNA和載體，使目的基

1—復(fù)制原點(diǎn)因兩側(cè)及載體上各自

標(biāo)記基因—具有兩個(gè)不同的黏性

基因表達(dá)載體模式圖+ALU

^而O

①目的基因：外源DNA分子中有遺傳效應(yīng)的片段。

②啟動子：位于基因的上游，緊挨轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)，是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)

的DNA片段，是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA,

最終表達(dá)出人類需要的蛋白質(zhì)。

③終止子：位于基因的下游，也是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，是轉(zhuǎn)

錄結(jié)束點(diǎn)。

④標(biāo)記基因的作用：為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目

的基因的細(xì)胞篩選出來。常用的標(biāo)記基因是抗生素抗性基因。

(4)基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程

(1)用一定的限制酶切割載體，使其出現(xiàn)一個(gè)黏性末端(或平末端)的切口。

(2)用限制酶切割目的基因，產(chǎn)生與載體一樣的黏性末端(或平末端)。

(3)將切下的目的基因片段與載體混合，再加入適量DNA連接酶，使載體與

目的基因結(jié)合成重組DNA分子(如圖)。

外源DNA

同一種限制酶或產(chǎn)生相

同末端的限制酶切割

兩個(gè)切口，獲得

DNA連接酶

一個(gè)切口,、目的基因

兩個(gè)黏性末端

基因表達(dá)載體

3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

(1)目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程，稱

為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的實(shí)質(zhì)是將目的基因整合到受體細(xì)胞的基因組中，可能存在于細(xì)胞

質(zhì)中，也可能整合到染色體DNA上。

(2)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法：根據(jù)受體和載體的類型不同，所采用的

導(dǎo)入方法也不同，見下表。

細(xì)胞種類植物細(xì)胞動物細(xì)胞微生物細(xì)胞

常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)基因槍法花粉管通道顯微注射Ca2+處理法

化法法技術(shù)(CaCC)

受體細(xì)胞受精卵或體細(xì)胞受精卵常用原核細(xì)

胞

轉(zhuǎn)化過程農(nóng)桿菌能單子葉植在植物受粉將含有目Ca?+處理細(xì)胞

在自然條物中常用后，花粉形成的基因的感受態(tài)細(xì)胞

件下侵染的一種基的花粉管還表達(dá)載體一將重組表

雙子葉植因轉(zhuǎn)化方未愈合前，剪提純一取達(dá)載體與感

物和裸子法,但是成去柱頭；然后卵(受精受態(tài)細(xì)胞混

植物，對大本較高。操滴力口DNA(含卵)一顯微合一＞感受態(tài)

多數(shù)單子作過程:將目的基因)至注射一將細(xì)胞吸收外

葉植物沒包裹在金花柱切面上，注射了目源DNA分子

有侵染能屬顆粒表使目的基因的基因的

力。將目的面的表達(dá)借助花粉管受精卵經(jīng)

基因插入載體DNA通道進(jìn)入胚早期胚胎

到Ti質(zhì)粒打入受體囊培養(yǎng)后移

的T-DNA細(xì)胞中，使入母體子

上轉(zhuǎn)入農(nóng)目的基因?qū)m或輸卵

桿菌導(dǎo)入與其整合管一獲得

植物細(xì)胞并表達(dá)具有新性

T整合到狀的動物

受體細(xì)胞

的染色體

DNA上一

表達(dá)

4.目的基因的檢測與鑒定

(1)檢測目的：目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，是否穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性,

只有通過檢測與鑒定才能知道。

(2)檢測對象：檢測轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因；檢測

目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA；檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)。

(3)檢測方法

類型檢測內(nèi)容方法結(jié)果顯示

分子目的基因是否插到從轉(zhuǎn)基因生物中提取DNA,用如果顯不出雜交

水平受體細(xì)胞的DNA上標(biāo)記的目的基因作探針，進(jìn)行帶,表明日的基因

檢測DNA分子雜交已插入染色體

DNA上

目的基因是否轉(zhuǎn)錄從轉(zhuǎn)基因生物中提取mRNA,如果顯示出雜父

出mRNA進(jìn)行分子雜交(DNA和mRNA帶,表明轉(zhuǎn)錄成功

之間雜交)

目的基因是否翻譯從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，如有雜交帶出現(xiàn)，

成蛋白質(zhì)用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原——表明目的基因已

抗體雜交形成蛋白質(zhì)產(chǎn)品

個(gè)體是否有抗性以及抗轉(zhuǎn)基因生物的抗性接種實(shí)驗(yàn)：是否賦予了預(yù)期

水平性的程度；基因工程比較基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)抗性或蛋白質(zhì)活

鑒定產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的品的功能活性性

功能活性是否相同

考點(diǎn)3基因工程的應(yīng)用

1.基因工程在農(nóng)牧業(yè)方面的應(yīng)用

(1)植物基因工程技術(shù)主要用于提高農(nóng)作物的抗逆能力(如抗除草劑、抗蟲、

抗病、抗干旱和抗鹽堿等)，以及改良農(nóng)作物的品質(zhì)和利用植物生產(chǎn)藥物等方

面O

⑵轉(zhuǎn)基因動物成果：動物轉(zhuǎn)基因工程主要用于動物品種改良、建立生物反

應(yīng)器、器官移植等。

2.基因工程在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用

(1)生產(chǎn)藥物：利用微生物或動植物的細(xì)胞生產(chǎn)藥物，對微生物或動植物的細(xì)

胞進(jìn)行基因改造使它們能夠生產(chǎn)藥物；轉(zhuǎn)基因哺乳動物批量生產(chǎn)藥物，科學(xué)家將

藥用蛋白基因與乳腺中特異表達(dá)的基因的啟動子等調(diào)控元件重組在一起，通過

顯微注射的方法導(dǎo)入哺乳動物的受精卵中，制成乳腺生物反應(yīng)器或乳房生物反

應(yīng)器。

(2)用轉(zhuǎn)基因動物做器官移植的供體

3.基因工程在食品工業(yè)方面的應(yīng)用

(1)用基因工程的方法，使外源基因得到高效率表達(dá)的菌類一般稱為基因工

程菌。

(2)利用基因工程菌生產(chǎn)食品工業(yè)用酶、氨基酸和維生素等

考點(diǎn)4蛋白質(zhì)工程的原理和應(yīng)用

1.蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，

通過改造或合成基因，來改造現(xiàn)有蛋白質(zhì)，或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類

生產(chǎn)和生活的需求?？梢哉f，蛋白質(zhì)工程是在基因工程的基礎(chǔ)上，延伸出來的第

二代基因工程，是包含多學(xué)科的綜合科技工程。

(1)蛋白質(zhì)工程的目標(biāo)：：根據(jù)人們對蛋白質(zhì)功能的特定需求，對蛋白質(zhì)的分

子結(jié)構(gòu)進(jìn)行設(shè)計(jì)改造，生產(chǎn)符合人們需求的、自然界中不存在的蛋白質(zhì)。

(2)蛋白質(zhì)工程的實(shí)質(zhì)：：由于基因決定蛋白質(zhì)，因此要對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行

設(shè)計(jì)改造，最終還必須通過改造或合成基因來完成。

(3)蛋白質(zhì)工程的的流程(下圖)：從預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā)一設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白

質(zhì)結(jié)構(gòu)一推測應(yīng)有的氨基酸序列一找到并改變相對應(yīng)的脫氧核甘酸序列(基因)

或合成新的基因一獲得所需要的蛋白質(zhì)。

2.蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用

(1)醫(yī)藥工業(yè)方面：研發(fā)藥物，如延長干擾素的保存時(shí)間；降低小鼠單克隆抗

體誘發(fā)免疫反應(yīng)的強(qiáng)度。

(2)其他工業(yè)方面：改進(jìn)酶的性能或開發(fā)新的工業(yè)用酶。

(3)農(nóng)業(yè)方面：通過改造某些參與調(diào)控光合作用的酶，增加糧食產(chǎn)量；改造微

生物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)優(yōu)良微生物農(nóng)藥，防治病蟲害。

~/03/~

易混易錯(cuò)

易錯(cuò)點(diǎn)1明辨限制酶的特點(diǎn)與使用特點(diǎn)

(1)限制酶具有特異性，即一種限制酶只能識別特定的核昔酸序列，并在特定的位點(diǎn)上進(jìn)行切割；限制

酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在該酶的識別序列或識別序列己經(jīng)被修飾。

(2)在獲取目的基因和切割載體時(shí)通常用同一種限制酶，以獲得相同的黏性末端。但如果用兩種不同限

制酶切割后形成的黏性末端相同，在DNA連接酶的作用下目的基因與載體也可以連接起來。

易錯(cuò)點(diǎn)2DNA連接酶和DNA聚合酶的區(qū)別

(l)DNA連接酶連接的是兩個(gè)DNA片段，而DNA聚合酶是把單個(gè)的脫氧核甘酸連接到已有的DNA

片段上。

(2)DNA聚合酶起作用時(shí)需要以一條DNA鏈為模板，而DNA連接酶不需要模板。

易錯(cuò)點(diǎn)3圖解限制酶的選擇原則

PstISmaIPstI

SmaI抗病EcoRI

基因

甲

(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstI,而不選擇Smal。

(2)保留標(biāo)記基因、啟動子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)原則：質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因，所以所選擇的

限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇SmaIo

(3)確保出現(xiàn)相同黏性末端原則：通常選擇與切割目的基因相同的限制酶，如圖甲中PstI；為避免目

的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇PstI

和EcoRI兩種限制酶。

易錯(cuò)點(diǎn)4與DNA相關(guān)的五種酶的總結(jié)比較

名稱作用部位作用結(jié)果

限制酶磷酸二酯鍵將DNA切成兩個(gè)片段

DNA連接酶磷酸二酯鍵將兩個(gè)DNA片段連接為一個(gè)DNA分子

DNA聚合酶磷酸二酯鍵將單個(gè)脫氧核甘酸依次連接到單鏈末端

DNA(水解)酶磷酸二酯鍵將DNA片段水解為單個(gè)脫氧核甘酸

解旋酶堿基對之間的氫鍵將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈，形成兩條長鏈

易錯(cuò)點(diǎn)5基因工程中的載體與膜載體的區(qū)別

基因工程中的載體是DNA分子，能將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞內(nèi)，并利用它在宿主細(xì)胞內(nèi)對目的基因

進(jìn)行大量復(fù)制；膜載體是蛋白質(zhì)，與細(xì)胞膜的通透性有關(guān)。

易錯(cuò)點(diǎn)6DNA的粗提取與鑒定的注意事項(xiàng)

(1)如果以菜花為實(shí)驗(yàn)材料，由于它的硬度較高，容易出現(xiàn)研磨不充分的情況，需要延長研磨的時(shí)間。

如果以洋蔥為實(shí)驗(yàn)材料，它的氣味相對刺激，可以為學(xué)生準(zhǔn)備護(hù)目鏡，并注意通風(fēng)。不同的實(shí)驗(yàn)材料，其

DNA的含量有所差別，香蕉、草莓、魚白等材料中的DNA含量較高。

(2)DNA與二苯胺試劑作用呈現(xiàn)藍(lán)色。鑒定時(shí)溶液藍(lán)色的深淺，與溶液中DNA含量的多少有關(guān)。

易錯(cuò)點(diǎn)7基因表達(dá)載體的構(gòu)建總結(jié)

(1)需要用到的工具：限制酶、DNA連接酶、載體。

(2)基因表達(dá)載體組成包含目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因等。

(3)基因表達(dá)載體要能在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并且可以遺傳給下一代，還要能表達(dá)和發(fā)揮作用。

(4)啟動子(DNA片段)W起始密碼子(RNA)；終止子(DNA片段)力終止密碼子(RNA)。

(5)目的基因的插入位點(diǎn)不是隨意的，基因表達(dá)需要啟動子和終止子的調(diào)控，所以目的基因應(yīng)插入啟動

子和終止子之間的部位。

(6)構(gòu)建基因表達(dá)載體一般用同種限制酶切割載體和目的基因。也可用兩種限制酶切割，以避免質(zhì)粒或

目的基因自身連接。

(7)限制酶切割載體時(shí)不能破壞標(biāo)記基因，以避免標(biāo)記基因不能表達(dá)，不能篩選出含有目的基因的受體

細(xì)胞。

易錯(cuò)點(diǎn)8農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法易錯(cuò)總結(jié)

(1)農(nóng)桿菌特點(diǎn)：易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力。

(2)原理：Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。

(3)農(nóng)桿菌的作用是感染植物細(xì)胞，把目的基因插入到植物細(xì)胞的染色體的DNA上o

(4)用農(nóng)桿菌感染時(shí)，優(yōu)先選擇受傷的(受傷的/完好的)葉片與重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌培養(yǎng)，選用該葉片的理

由是葉片傷口處的細(xì)胞可釋放大量的酚類物質(zhì)，可吸引農(nóng)桿菌。

(5)若要利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化單子葉植物細(xì)胞，可采取添加酚類物質(zhì)，其目的是吸引農(nóng)桿菌移向受體

細(xì)胞，有利于目的基因成功轉(zhuǎn)化。

(6)利用Ti質(zhì)粒構(gòu)建重組質(zhì)粒的目的是：將目的基因插入到Ti質(zhì)粒上的T-DNA上，利用其將目的基因

導(dǎo)入受體細(xì)胞并整合到受體細(xì)胞染色體DNA上，使目的基因的遺傳特性穩(wěn)定維持和表達(dá)。

易錯(cuò)點(diǎn)9基因?qū)雱游锛?xì)胞受體細(xì)胞選受精卵而不是正常體細(xì)胞的原因

(1)受精卵具有全能性且體積大，易操作；而動物體細(xì)胞的全能性受限。

(2)過程：

提純含目的子因表達(dá)載體

取卵受精卵

顯斌注射

I

受精卵發(fā)育

I早期胚胎

移植到子宮

新性h動物

易錯(cuò)點(diǎn)10Ca2+處理法(感受態(tài)細(xì)胞法)

(1)受體細(xì)胞用Ca2+處理的目的是使其變?yōu)楦惺軕B(tài)細(xì)胞，容易吸收周圍環(huán)境中的DNA分子。

(2)用Ca2+處理受體細(xì)胞是通過改變細(xì)胞壁的通透性來完成

~~/04/~

真題賞析

1.(2024?江西?高考真題小氨基丁酸在醫(yī)藥等領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價(jià)值。利用L-谷氨酸脫竣酶(GadB)催化L-

谷氨酸脫竣是高效生產(chǎn)上氨基丁酸的重要途徑之一。研究人員采用如圖方法將釀酒酵母S的L-谷氨酸脫竣

酶基因(gadB)導(dǎo)入生產(chǎn)菌株E.coliA.構(gòu)建了以L-谷氨酸鈉為底物高效生產(chǎn)/氨基丁酸的菌株E.coliBo

下列敘述正確的是()

oI和Kpn

gQ-

d質(zhì)粒

(含多克隆位點(diǎn))

NeoI和KpnI

雙酶切

P--C--R-------------A

gadB

E.coliB

釀酒酵母s

A.上圖表明，可以從釀酒酵母S中分離得到目的基因gadB

B.E.coliB發(fā)酵生產(chǎn)/氨基丁酸時(shí)，L-谷氨酸鈉的作用是供能

C.E.coliA和E.coliB都能高效降解%氨基丁酸

D.可以用其他酶替代NeoI和KpnI構(gòu)建重組質(zhì)粒

［答案］D.［解析］A、不能直接從釀酒酵母S中分離得到目的基因gadB,只能分離得到含有目的基因

gadB序列的染色體DNA,如題圖所示，若要獲取目的基因，需要進(jìn)行PCR,A錯(cuò)誤。B、題意顯示，用

L-谷氨酸脫竣酶(GadB)催化L-谷氨酸脫竣是高效生產(chǎn)行氨基丁酸的重要途徑之一，E.coliB中能表達(dá)L-

谷氨酸脫竣酶(GadB),因此可用E.coliB發(fā)酵生產(chǎn)丫-氨基丁酸，該過程中L-谷氨酸鈉的作用不是供能，

B錯(cuò)誤；C、E.coliA中沒有L-谷氨酸脫竣酶(GadB),因而不能降解L-谷氨酸，而E.coliB中含有該酶

的基因，因而能高效降解L-谷氨酸，高效生產(chǎn)上氨基丁酸，C錯(cuò)誤；D、圖中質(zhì)粒下方括號內(nèi)備注含多克

隆位點(diǎn)，表明質(zhì)粒上含有多種限制酶的識別序列，除了NeoI和KpnI外還有其他的限制酶可選，此外，

PCR產(chǎn)物也未必非要用這兩種酶，而是可以用同尾酶替代，D正確。故選D。

知識鏈接：基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動子、終止子

和標(biāo)記基因等，標(biāo)記基因可便于目的基因的鑒定和篩選。

2.(2024?湖南?高考真題)某同學(xué)將質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制酶酶切時(shí)，發(fā)現(xiàn)DNA完全沒有被酶切，分析可能的

原因并提出解決方法。下列敘述錯(cuò)誤的是()

A.限制酶失活，更換新的限制酶

B.酶切條件不合適，調(diào)整反應(yīng)條件如溫度和酶的用量等

C.質(zhì)粒DNA突變導(dǎo)致酶識別位點(diǎn)缺失，更換正常質(zhì)粒DNA

D.酶切位點(diǎn)被甲基化修飾，換用對DNA甲基化不敏感的限制酶

［答案］B.［解析］A、限制酶失活會使DNA完全不被酶切，此時(shí)應(yīng)更換新的限制酶，A正確；B、酶切

條件不合適通常會使切割效果下降，調(diào)整反應(yīng)條件如溫度和PH等，調(diào)整酶的用量沒有作用，B錯(cuò)誤；

C、質(zhì)粒DNA突變會導(dǎo)致限制酶識別位點(diǎn)缺失，進(jìn)而造成限制酶無法進(jìn)行切割，此時(shí)應(yīng)更換為正常質(zhì)

粒，C正確；D、質(zhì)粒DNA上酶切位點(diǎn)被甲基化修飾，會導(dǎo)致對DNA甲基化敏感的限制酶無法進(jìn)行酶

切，此時(shí)應(yīng)換用對DNA甲基化不敏感的限制酶，D正確。故選B。

知識鏈接：限制酶特異性識別并切割DNA上的特定位點(diǎn)。

3.(2024?安徽?高考真題)下列關(guān)于“DNA粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的敘述，錯(cuò)誤的是()

A.實(shí)驗(yàn)中如果將研磨液更換為蒸儲水，DNA提取的效率會降低

B.利用DNA和蛋白質(zhì)在酒精中的溶解度差異，可初步分離DNA

C.DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同，該原理可用于純化DNA粗提物

D.將溶解的DNA粗提物與二苯胺試劑反應(yīng)，可檢測溶液中是否含有蛋白質(zhì)雜質(zhì)

［答案］D.［解析］A、研磨液有利于DNA的溶解，換為蒸儲水，DNA提取的效率會降低，A正確；

B、DNA不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)溶于酒精，可分離DNA,B正確；C、DNA在NaCl溶

液中的溶解度隨著NaCl濃度的變化而改變，因此可用不同濃度的NaCl溶液對DNA進(jìn)行粗提取，C正

確；D、在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺會被染成藍(lán)色，二苯胺試劑用于鑒定DNA,D錯(cuò)誤。故選

Do

知識鏈接：DNA粗提取和鑒定的原理：

(l)DNA的溶解性：DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精

溶液，但細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)溶于酒精；DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性。

(2)DNA的鑒定：在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺會被染成藍(lán)色。

4.(2024?福建?高考真題)病毒感染初期，機(jī)體會分泌干擾素并作用于細(xì)胞受體IFNAR來應(yīng)對感染。麻疹是

由麻疹病毒感染引起的急性傳染病。已知人白細(xì)胞分化抗原46(hCD46)是麻疹病毒入侵細(xì)胞的主要受體，

小鼠沒有該受體，科研人員構(gòu)建hCD46轉(zhuǎn)基因小鼠用于相關(guān)研究，部分流程如圖所示?；卮鹣铝袉栴}：

碌、I啟動子EcoRI

￡coRIBamHISacl

INotl

+質(zhì)粒終止子

hCD46

卡那霉素

Hin6

抗性基因m

⑴利用PCR技術(shù)獲取目的基因hCD46,復(fù)性溫度下發(fā)生的擴(kuò)增過程是

(2)將hCD46接入質(zhì)粒應(yīng)選用的限制酶組合是o為提高轉(zhuǎn)基因效率，同時(shí)避免標(biāo)記基因進(jìn)入胚胎

體內(nèi)，應(yīng)選用限制酶組合將重組質(zhì)粒變?yōu)榫€性DNA。

(3)為獲取大量胚胎用于移植，可用激素處理小鼠a,使其o將胚胎移植到小鼠c的子宮中，應(yīng)選

用桑甚胚的原因是o

(4)利用PCR技術(shù)對子代小鼠進(jìn)行hCD46基因檢測，應(yīng)設(shè)置不加DNA模板的對照組，目的是。

(5)若能進(jìn)一步構(gòu)建既表達(dá)hCD46受體又敲除IFNAR基因的小鼠，則該小鼠對麻疹病毒具有高易感

性，原因是o

［答案］⑴兩種引物分別與含hCD46基因的兩條模板鏈結(jié)合

(2)EcoRI和NotlAgeI和HindlU

(3)超數(shù)排卵桑甚胚易于在小鼠子宮著床

(4)排除PCR體系中外源DNA的污染

(5)該小鼠能被麻疹病毒感染，且干擾素?zé)o法作用于IFNAR以應(yīng)對感染

［解析］⑴利用PCR技術(shù)獲取目的基因hCD46,復(fù)性溫度下發(fā)生的變化是兩種引物分別與解開的兩條

模板鏈進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對，為子鏈的延伸做準(zhǔn)備，即表現(xiàn)為兩種引物分別與含hCD46基因的兩條模板鏈

結(jié)合

(2)結(jié)合圖示可知，質(zhì)粒中以及目的基因的兩端含有限制酶EcoRI和Notl的識別序列，且這兩個(gè)序列

位于啟動子和終止子之間，因此，將hCD46接入質(zhì)粒應(yīng)選用的限制酶組合是EcoRI和NotL為提高轉(zhuǎn)基

因效率，同時(shí)避免標(biāo)記基因進(jìn)入胚胎體內(nèi)，應(yīng)選用AgeI和HindUI限制酶組合將重組質(zhì)粒變?yōu)榫€性

DNA,因?yàn)檫@兩種限制酶可以將重組質(zhì)粒分為含目的基因的片段和含有標(biāo)記基因的片段。

(3)為獲取大量胚胎用于移植，可用激素處理小鼠a,使其超數(shù)排卵，為獲取大量的供體胚胎做準(zhǔn)備。

將胚胎移植到小鼠c的子宮中，通常選用桑蔓胚的原因是因?yàn)樯Ｒ馀咭子谠谛∈笞訉m著床，進(jìn)而可以提高

胚胎的存活率。

(4)利用PCR技術(shù)對子代小鼠進(jìn)行hCD46基因檢測，應(yīng)設(shè)置不加DNA模板的對照組作為空白對照，

這樣可以排除PCR體系中外源DNA的污染，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。

(5)若能進(jìn)一步構(gòu)建既表達(dá)hCD46受體又敲除IFNAR基因的小鼠，則該轉(zhuǎn)基因小鼠能接受抗原刺

激，進(jìn)而機(jī)體會分泌干擾素，但干擾素?zé)o法與相應(yīng)的受體結(jié)合，因?yàn)檗D(zhuǎn)基因小鼠的受體IFNAR無法表

達(dá)，因而干擾素?zé)o法起作用，因此，該小鼠對麻疹病毒具有高易感性。

知識鏈接：PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫。PCR是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。

通過這一技術(shù)，可以獲取大量的目的基因。PCR擴(kuò)增反應(yīng)需要兩種引物、模板DNA、原料(4種脫氧核營

酸）、酶（耐高溫的DNA聚合酶）。PCR反應(yīng)過程是：變性一復(fù)性一延伸。

5.（2024?重慶?高考真題）大豆是重要的糧油作物，提高大豆產(chǎn)量是我國農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的重要任務(wù)。我國研究人

員發(fā)現(xiàn)，基因S在大豆品種DN（種子較大）中的表達(dá)量高于品種TL（種子較?。缓罂寺×嗽摶颍▋善贩N

中基因S序列無差異）及其上游的啟動子序列，并開展相關(guān)研究。

①友達(dá)我體

限制■識牌位點(diǎn)

②后動子IX基因S

5C............TAGAATTCCA-..........3'

3’...........ATlTTAAliGT………S'

③四神朱*1薛識別序列及切割位點(diǎn)

/AmdllltAjpvltEcnRl：Mwh

S'&iCTT3'5'4CTAGTT5'&ATTC3'5rRTAGA3,

JTTCC3TGATCA5'3VTTAAGS'3AGATCT5'

注，II頭表示*的切割位■

（1）基因S啟動子的基本組成單位是

⑵通過基因工程方法，將DN克隆的“啟動子D+基因S”序列導(dǎo)入無基因S的優(yōu)質(zhì)大豆品種YZ。根據(jù)題

19圖所示信息（不考慮未標(biāo)明序列）判斷構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，為保證目標(biāo)序列的完整性，不宜使用的限制

酶是；此外，不宜同時(shí)選用酶Spel和Xbal。原因是。

（3）為驗(yàn)證“啟動子D+基因S”是否連接在表達(dá)載體上，可用限制酶對重組表達(dá)載體酶切后進(jìn)行電泳。電

泳時(shí)，對照樣品除指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物外，還應(yīng)有o經(jīng)驗(yàn)證的重組表達(dá)載體需轉(zhuǎn)入農(nóng)

桿菌，檢測轉(zhuǎn)入是否成功的技術(shù)是o

（4）用檢測后的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化品種YZ所得再生植株YZ-1的種子變大。同時(shí)將從TL克隆的“啟動子T+基

因S”序列成功導(dǎo)入YZ,所得再生植株YZ-2的種子也變大，但小于YZ-1。綜合分析，大豆品種DN較TL

種子大的原因是o

［答案］（1）脫氧核糖核甘酸（脫氧核甘酸）

（2）EcoRi酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我環(huán)化；不能保證目標(biāo)片段與載體定向

鏈接（反向鏈接）

（3）酶切后的空載體片段，啟動子D+基因S片段PCR

（4）品種DN的基因S上游啟動子效應(yīng)比TL強(qiáng)，使得基因S表達(dá)量更高，種子更大

［解析］⑴啟動子是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，用于啟動DNA的轉(zhuǎn)錄，是一段DNA片段，其基

本組成單位是四種脫氧核糖核甘酸。

（2）①根據(jù)圖示信息可知，“啟動子D+基因S”的DNA序列上存在EcoRI的識別序列，若使用限制

酶EcoRI,會使目的基因序列被破壞；

②根據(jù)圖中限制酶的識別序列可知，酶SpeI和XbaI切割產(chǎn)生的黏性末端相同，若用這兩種限制

酶切割，形成的DNA片段在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，容易出現(xiàn)自我環(huán)化，以及無法保證目的基因片段與載

體片段單向連接，影響目的基因在受體細(xì)胞中的表達(dá)。

(3)①DNA電泳可以分離不同大小的DNA片段，用限制酶對重組表達(dá)載體酶切后的產(chǎn)物不僅有“啟動

子D+基因S”片段，還有酶切后的空載體片段，因此電泳時(shí)，對照樣品除指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物外，

還應(yīng)有酶切后的空載體片段和“啟動子D+基因S”片段；

②在分子水平上檢測目的基因是否轉(zhuǎn)入成過可通過PCR等技術(shù)檢測受體細(xì)胞的DNA上是否插入目的

基因或目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNAo

(4)根據(jù)(4)題目信息可知，再生植株YZ-1導(dǎo)入的目的基因?yàn)槿∽云贩NDN的“啟動子D+基因S”序

列，再生植株YZ-2導(dǎo)入的目的基因?yàn)槿∽云贩NTL的“啟動子T+基因S”序列，結(jié)合題干信息“兩品種中

基因S序列無差異”可推測：品種DN的基因S上游的啟動子D的效應(yīng)強(qiáng)于品種TL的啟動子T,啟動子

D使基因S表達(dá)量更高，因而種子更大。

知識鏈接：基因工程技術(shù)的基本步驟：(1)目的基因的獲取:方法有從基因文庫中獲取、利