DB12-T1190-2023牛乳中A2型β-酪蛋白（A2奶）檢測技術規(guī)程

ICS65.020.30

CCSB45

12

天津市地方標準

DB12/T1190—2023

牛乳中A2型β-酪蛋白（A2奶）鑒別技術

規(guī)程

CodeofpracticeforidentificationofA2typeofβ-casein(A2milk)incow'smilk

2023-04-07發(fā)布2023-05-07實施

天津市市場監(jiān)督管理委員會??發(fā)布

DB12/T1190—2023

牛乳中A2型β-酪蛋白（A2奶）鑒別技術規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了的牛奶中A2型β-酪蛋白（A2奶）的檢測原理、主要試劑配制、主要儀器設備、質譜檢

測及數(shù)據(jù)處理參數(shù)、檢測方法、結果判定、廢棄物的處理和檢測過程中防止交叉污染的措施。

本文件適用于牛奶和奶粉中A2型β-酪蛋白（A2奶）的檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和實驗方法

GB/T19495.2轉基因產品檢測實驗室技術要求

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1

A2型β-酪蛋白A2β-casein；A2CSN2

β-酪蛋白由209個氨基酸組成，其一級序列中的第67位氨基酸的種類為脯氨酸（Proline,P）時，

稱為A2型β-酪蛋白。

3.2

A2奶A2milk

所含β-酪蛋白為A2型的牛奶。

3.3

質荷比mass-to-chargeratio

離子的質量m與其所帶的電荷數(shù)z之比，以m/z表示。

4檢測原理

β-酪蛋白變體型對應的氨基酸突變位點為第67位組氨酸（Histidine,H）突變?yōu)楦彼幔≒roline,

P），不同氨基酸之間存在分子量差異。利用質譜分析技術，根據(jù)差異肽段的分子量及質荷比差異將樣

品蛋白質中存在氨基酸突變的肽段鑒定出來，從而確定氨基酸突變位點，實現(xiàn)對不同突變體型β-酪蛋白

檢測的目的。

5試劑配制

實驗所用水為符合GB/T6682規(guī)定的一級水；高壓滅菌條件為121℃，1.034*105Pa壓力，蒸汽滅菌

20min。試劑配制如下：

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——樣品裂解液：將480.4g尿素，7.1gHEPES溶于800mL蒸餾水中，充分溶解后，定容至1L；

——10%SDS（十二烷基硫酸鈉）：將10gSDS粉末溶于80mL蒸餾水中，加熱至68℃助溶，用

HCl調pH至7.2，定容至1000mL，0.2μm的濾膜過濾，高壓滅菌；

——30%丙烯酰胺：將29g丙烯酰胺和1gN,N'-亞甲雙丙烯酰胺溶于總體積為60mL的蒸餾水中，

充分溶解后，定容至100mL；

——1.5mol/LTris-HCl（pH=8.8）：將181.65gTris溶于800mL水中，加濃鹽酸調pH至8.8，

容至1000mL；

——1mol/LTris-HCl（pH=6.8）：將121.1gTris溶于800mL水中，加濃鹽酸調pH至6.8，容

至1000mL；

——10%過硫酸銨：將10g過硫酸銨粉末溶于80mL蒸餾水中，充分溶解后，定容至100mL；

——考馬斯亮藍染色液：量取甲醇45mL，蒸餾水45mL，冰乙酸10mL，加入0.25g考馬斯亮藍

R-250；

——考染脫色液：50mL碳酸氫銨/乙腈=1：1；

——1μg/μL胰蛋白酶：將100μg胰蛋白酶溶解到100μL50mmol/L乙酸中，-70℃儲存；

——25mmol/L碳酸氫銨：將2.0碳酸氫銨溶于800mL蒸餾水中，充分溶解后，定容至1L。

6儀器設備

6.1單道可調移液器

0.25～2.5μl、1～10μl、2～20μl、5～50μl、10～100μl、20～200μl、100～1000μl。

6.210K超濾管

超濾管截留蛋白分子量：30～90KDa。

6.3離心機

最高轉速12000r/min，最大容量24×1.5mL。

6.4電子天平

萬分之一精度。

6.5凝膠成像分析系統(tǒng)

有膠像素1280×1024，檢測靈敏度DNA≥0.05ng。

6.6穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀

輸出電壓0～600V，輸出電流0～100mA。

6.7垂直電泳槽

外形尺寸15cm×12cm×13cm，凝膠板面積10cm×10cm。

6.8高壓滅菌鍋

使用溫度范圍45～135℃，最高使用壓力0.255Mpa。

6.9自動雙重純水蒸餾器

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DB12/T1190—2023

功率3000W，出水量2500mL/h。

6.10微波爐

功率700W，容積20L。

6.11冰箱

4℃，-20℃。

6.12電熱恒溫水浴鍋

RT+5～70℃

7質譜檢測及數(shù)據(jù)處理參數(shù)

應按照附錄A執(zhí)行。

8檢測方法

8.1樣本采集

每頭奶牛采集新鮮牛奶（排除頭奶和末乳）50mL，充分混勻后，-80℃保存。

8.2蛋白提取

8.2.1從-80℃取出牛奶樣本，常溫解凍后充分混勻，取樣50μL。

8.2.2向上述樣品中加入500μL裂解液[8mol/L尿素，30mmol/L4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）]。

冰上裂解10min。4℃，20000g，離心30min。取上清，避免吸到油脂。

8.2.3加入二硫蘇糖醇（DTT）至終濃度10mmol/L。56℃水浴1h。取出后，迅速加入碘乙酰胺（IAM）

至終濃度55mmol/L，暗室靜置1h。

8.2.4使用考馬斯藍染色法（Bradford法）對蛋白質進行定量。

8.2.5對定量后的蛋白質進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）分析（如附錄C.1）。

8.3蛋白質的消化

8.3.1取8.2.5中蛋白20μg，加入到10K超濾管中，14000g，4℃，離心40min，棄廢液。

8.3.2加入200μL的25mmol/L碳酸氫銨（NH4HCO3），14000g，4℃，離心40min，棄廢液。

8.3.3重復8.3.2步驟兩遍。

8.3.4加入1μg/μL的胰蛋白酶（Trypsin）和V8蛋白酶（Glu-C）各1μL，37℃水浴24h。離心

收集消化后的肽段。

8.3.5真空抽干消化后的肽段。

8.3.60.1%甲酸（FA）復溶肽段。

8.4質譜鑒定

8.4.1將8.3.5提取的酪蛋白肽段進行上機檢測。使用高效液相色譜-四級桿-飛行時間質譜儀對獲得

的酪蛋白肽段進行分離并檢測，液相及質譜檢測參數(shù)見表1～表3。

3

DB12/T1190—2023

表1液相色譜柱參數(shù)

項目參數(shù)

色譜柱WatersXbridgeBEH300C18(100mm×2.1mm3.5μm)

流動相A0.2%甲酸-水(v/v)

流動相B0.2%甲酸乙腈(v/v)

柱溫箱40℃

流速0.3mL/min

進樣體積5μL

表2液相色譜流動相洗脫梯度

時間（分）B液比例

02%

22%

510%

2040%

2295%

2595%

25.12%

282%

表3質譜檢測-離子源參數(shù)

參數(shù)名稱參數(shù)值

離子模式正離子模式

母離子掃描范圍50-2000m/z

二級分辨率30000

離子源溫度500

離子化電壓5500V

采集模式數(shù)據(jù)依賴型采集(Independentdataacquired,IDA)

碰撞能量35±15V

氣簾氣氮氣35psi

霧化氣氮氣50psi

輔助加熱氣氮氣50psi

8.4.2對原始數(shù)據(jù)進行過濾、峰提取和篩選，確定特征性肽段。質譜掃描完畢，得到質譜原始文件，

將質譜原始數(shù)據(jù)文件導入后，進行一級色譜峰的濾噪、峰提取、篩選出含有p.67位氨基酸的特征肽段，

4

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篩選參數(shù)見表4。

表4質譜峰篩選參數(shù)

參數(shù)名稱實驗選項

母離子質量范圍50-2000Da

質量偏差寬度0.02Da

0.2min

保留時間偏差

信噪比S/N域值3

8.4.3篩選后的差異性肽段用Proteinpilot軟件進行差異肽段序列的比對和鑒定，檢索參數(shù)見表5。

表5鑒定檢索參數(shù)

參數(shù)名稱參數(shù)條件

烷基化試劑碘乙酰胺

可變修飾Oxidation(M),Gln→Pyro-Glu(N-termQ)

Phospho(ST),Ser→Arg(S),Ser→Lys(S),Arg→Cys(R),Gln→Glu(Q),

Glu→Lys(E),Met→Leu(M),Pro→His(P),Pro→Leu(P),His→Gln(H)

質量偏差0.35Da

最大允許漏切數(shù)1

酶的類型(Enzyme)Trypsin

置信度(FDR)>95%

數(shù)據(jù)庫(Database)/_Bostaurus

9結果判定

9.1SDS鑒定

將從樣品中提取的蛋白質進行SDS分離鑒定，檢測蛋白條帶是否清晰無降解。條帶清晰，表示

可用于后續(xù)檢測，否則重新取樣鑒定，檢測結果見圖1。

5

DB12/T1190—2023

圖1SDS檢測結果（紅框內條帶為β-酪蛋白）

9.2A2型β-酪蛋白的判定

根據(jù)質譜鑒定結果，當待測樣品的