分析方法驗(yàn)證理論培訓(xùn)

目錄一、前言二、分析方法驗(yàn)證

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基本概念

·方法驗(yàn)證的一般原則

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驗(yàn)證內(nèi)容三、不同驗(yàn)證項(xiàng)目?jī)?nèi)容的具體要求

·準(zhǔn)確度·線性·精密度·范圍

·專屬性·檢測(cè)限·定量限·耐用性·系統(tǒng)適用性·溶液穩(wěn)定性前言

在進(jìn)行質(zhì)量研究的過程中，一項(xiàng)重要的工作就是要對(duì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中所涉及到的分析方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，以保證所用的分析方法確實(shí)能夠用于在研藥品的質(zhì)量控制。方法驗(yàn)證 ——新方法的建立定義:

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)項(xiàng)目的要求,設(shè)定驗(yàn)證的內(nèi)容,

設(shè)計(jì)合理的試驗(yàn)方案并完成操作的過程目的: 證明方法能夠滿足檢驗(yàn)項(xiàng)目的要求作用:

方法建立的依據(jù);制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)方法確認(rèn) ——已驗(yàn)證(如藥典)方法的應(yīng)用/方法轉(zhuǎn)移目的:

證明在本實(shí)驗(yàn)室條件下的適用性,部分驗(yàn)證:

鑒別(專屬性);含量測(cè)定(+重現(xiàn)性);雜質(zhì)檢查(+靈/重)·基本概念·方法驗(yàn)證的一般原則需驗(yàn)證的檢驗(yàn)項(xiàng)目與方法鑒別;雜質(zhì)檢查(限度或定量);含量測(cè)定(定量)三個(gè)項(xiàng)目驗(yàn)證內(nèi)容根據(jù)檢驗(yàn)項(xiàng)目要求與分析方法特點(diǎn)確定無需驗(yàn)證的檢驗(yàn)項(xiàng)目與方法外觀,密度,酸值,pH,……氯化物,硫酸鹽,干燥失重,熾灼殘?jiān)?……重量差異,崩解時(shí)限,裝量,裝量差異,……需特殊或非常規(guī)驗(yàn)證的方法粒度分布;旋光度;熔點(diǎn);硬度·不同驗(yàn)證項(xiàng)目?jī)?nèi)容的具體要求1準(zhǔn)確度測(cè)定結(jié)果與真實(shí)值/參考值接近的程度用回收率(%)表示在規(guī)定范圍內(nèi)驗(yàn)證驗(yàn)證方法見表3數(shù)據(jù)要求見表3表3準(zhǔn)確度驗(yàn)證方法檢驗(yàn)項(xiàng)目主成分含量測(cè)定有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法驗(yàn)證時(shí)一般要求分別配制濃度為80％、100％和120％的供試品溶液各三份，分別測(cè)定其含量，將實(shí)測(cè)值與理論值比較，計(jì)算回收率。驗(yàn)證時(shí)一般要求根據(jù)有關(guān)物質(zhì)的定量限與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中該雜質(zhì)的限度分別配制三個(gè)濃度的供試品溶液各三份（例如某雜質(zhì)的限度為0.2%，則可分別配制該雜質(zhì)濃度為0.1％、0.2％和0.3％的雜質(zhì)溶液），分別測(cè)定其含量，將實(shí)測(cè)值與理論值比較，計(jì)算回收率，并計(jì)算9個(gè)回收率數(shù)據(jù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）。接受標(biāo)準(zhǔn)各濃度下的平均回收率均應(yīng)在98.0%-102.0%之間，9個(gè)回收率數(shù)據(jù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）應(yīng)不大于2.0%。各濃度下的平均回收率均應(yīng)在80%-120%之間，如雜質(zhì)的濃度為定量限，則該濃度下的平均回收率可放寬至70%-130%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于10%。2線性檢測(cè)結(jié)果與試樣中被測(cè)物的濃度呈正比關(guān)系的程度在一定范圍內(nèi)驗(yàn)證驗(yàn)證方法見表4數(shù)據(jù)要求應(yīng)列出回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性圖表4線性驗(yàn)證方法檢驗(yàn)項(xiàng)目主成分含量測(cè)定有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法在80％至120％的濃度范圍內(nèi)配制6份濃度不同的供試液，分別測(cè)定其主峰的面積，計(jì)算相應(yīng)的含量。以含量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸分析。在定量限至一定的濃度范圍內(nèi)配制6份濃度不同的供試液，分別測(cè)定該雜質(zhì)峰的面積，計(jì)算相應(yīng)的含量。以含量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸分析。接受標(biāo)準(zhǔn)回歸線的相關(guān)系數(shù)（R）不得小于0.998，Y軸截距應(yīng)在100％響應(yīng)值的2％以內(nèi)，響應(yīng)因子的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于2.0%?；貧w線的相關(guān)系數(shù)（R）不得小于0.990，Y軸截距應(yīng)在100％響應(yīng)值的25％以內(nèi)，響應(yīng)因子的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于10%。3精密度多次測(cè)定同一均勻樣品的結(jié)果之間的接近程度用SD或RSD%表示在規(guī)定范圍內(nèi)驗(yàn)證(限度±20%)驗(yàn)證方法同一實(shí)驗(yàn)室:

重復(fù)性(連續(xù));中間精密度(不連續(xù));不同實(shí)驗(yàn)室:

重現(xiàn)性(方法轉(zhuǎn)移);方法見下表5數(shù)據(jù)要求多次測(cè)量值的SD或RSD%或平均值的可信限表5精密度驗(yàn)證方法檢驗(yàn)項(xiàng)目主成分含量測(cè)定有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法與標(biāo)準(zhǔn)

1）重復(fù)性

配制6份相同濃度的供試品溶液，由一個(gè)分析人員在盡可能相同的條件下進(jìn)行測(cè)試所得6份供試液含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于2.0%。

2）中間精密度

配制6份相同濃度的供試品溶液，分別由兩個(gè)分析人員使用不同的儀器與試劑進(jìn)行測(cè)試，所得12個(gè)含量數(shù)據(jù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于2.0%。1）重復(fù)性配制6份雜質(zhì)濃度（一般為0.1%）相同的供試品溶液，由一個(gè)分析人員在盡可能相同的條件下進(jìn)行測(cè)試，所得6份供試液含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于15%。

2）中間精密度配制6份雜質(zhì)濃度（一般為0.1%）相同的供試品溶液，分別由兩個(gè)分析人員使用不同的儀器與試劑進(jìn)行測(cè)試，所得12個(gè)含量數(shù)據(jù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于20%。4范圍指在特定的范圍內(nèi)，方法可以提供可信的準(zhǔn)確度、線性和精密度根據(jù)測(cè)試目的的不同，范圍應(yīng)至少涵蓋如下濃度：含量：80~120%含量均勻度：70~130%溶出度/釋放度：標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的±30%雜質(zhì)：從規(guī)定的50%或定量限（兩者取低者）到120%5專屬性專屬性系指：在其他成分（如雜質(zhì)、降解物、輔料等）可能存在下，采用的分析方法能夠正確鑒定、檢出被分析物質(zhì)的特性。應(yīng)用:鑒別,檢查,含量測(cè)定均驗(yàn)證專屬性如采用的方法不夠?qū)伲瑧?yīng)采用多個(gè)方法予以補(bǔ)充。不同驗(yàn)證項(xiàng)目接受標(biāo)準(zhǔn)見下表6表6專屬性驗(yàn)證方法檢驗(yàn)項(xiàng)目主成分含量測(cè)定有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法1）在雜質(zhì)可獲得的情況下，可向試樣中加入雜質(zhì)或輔料，與未加雜質(zhì)和輔料的試樣比較測(cè)定結(jié)果，看結(jié)果是否收到干擾2）在雜質(zhì)不能獲得時(shí)，可通過測(cè)試含有雜質(zhì)的試樣與另一個(gè)已驗(yàn)證的方法或藥典方法比較結(jié)果。或?qū)υ嚇舆M(jìn)行強(qiáng)光、高溫、酸堿處理進(jìn)行加速破壞，用兩種方法進(jìn)行測(cè)定比較測(cè)定結(jié)果。必要時(shí)可進(jìn)行二極管陣列和質(zhì)譜檢測(cè)進(jìn)行峰純度檢查。1）在雜質(zhì)可獲得的情況下，可向試樣中加入一定量的雜質(zhì)，考察雜質(zhì)與共存物質(zhì)能得到分離和檢出，并具有適當(dāng)?shù)臏?zhǔn)確度與精密度2）在雜質(zhì)不能獲得時(shí)，可通過測(cè)試含有雜質(zhì)的試樣與另一個(gè)已驗(yàn)證的方法或藥典方法比較結(jié)果?；?qū)υ嚇舆M(jìn)行強(qiáng)光、高溫、酸堿處理進(jìn)行加速破壞，研究可能的降解產(chǎn)物，并比對(duì)破壞前后檢出的雜質(zhì)個(gè)數(shù)。必要時(shí)可進(jìn)行二極管陣列和質(zhì)譜檢測(cè)進(jìn)行峰純度檢查。接受標(biāo)準(zhǔn)空白對(duì)照應(yīng)無干擾，主成分與各有關(guān)物質(zhì)應(yīng)能完全分離，分離度不得小于2.0。以二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行純度分析時(shí)，主峰的純度因子應(yīng)大于980?？瞻讓?duì)照應(yīng)無干擾，該雜質(zhì)峰與其它峰應(yīng)能完全分離，分離度不得小于2.0。6檢測(cè)限(LOD)定義:

樣品中被分析物可檢出的最低量應(yīng)用:雜質(zhì)檢查項(xiàng),根據(jù)具體情況確定是否驗(yàn)證限度試驗(yàn)——驗(yàn)證定量測(cè)定——根據(jù)定量限(LOQ)與報(bào)告限確定驗(yàn)證方法:信噪比法

即把已知低濃度試樣檢測(cè)出的信號(hào)與空白樣品測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行比較，計(jì)

算出能被可靠的檢測(cè)出的最低濃度或量。一般以信噪比為3:1或2:1時(shí)的

相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定檢測(cè)限。

檢驗(yàn)項(xiàng)目主成分含量測(cè)定有關(guān)物質(zhì)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)主峰與噪音峰信號(hào)的強(qiáng)度比應(yīng)不得小于3。雜質(zhì)峰與噪音峰信號(hào)的強(qiáng)度比應(yīng)不得小于3。7定量限(LOQ)定義:

樣品中被分析物可定量測(cè)定的最低量

——測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度與精密度符合要求應(yīng)用:雜質(zhì)定量測(cè)定(有關(guān)物質(zhì)檢查方法學(xué)研究)驗(yàn)證方法:信噪比法標(biāo)準(zhǔn)偏差法

檢驗(yàn)項(xiàng)目主成分含量測(cè)定有關(guān)物質(zhì)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)主峰與噪音峰信號(hào)的強(qiáng)度比應(yīng)不得小于10。另外，配制6份最低定量限濃度的溶液，所測(cè)6份溶液主峰的保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于2.0%。雜質(zhì)峰與噪音峰信號(hào)的強(qiáng)度比應(yīng)不得小于10。另外，配制6份最低定量限濃度的溶液，所測(cè)6份溶液雜質(zhì)峰保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于2.0%，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于5.0%。8耐用性定義:

測(cè)定結(jié)果不受影響,條件允許變動(dòng)范圍

——測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度與精密度符合要求應(yīng)用:所有項(xiàng)目(與專屬性一樣)方法：見表7結(jié)果體現(xiàn):范圍窄——如HPLC柱溫25±2℃,標(biāo)注為25℃范圍寬——如HPLC柱溫10~30℃,無需標(biāo)注方法耐用性影響因素示例表7耐用性驗(yàn)證方法檢驗(yàn)項(xiàng)目主成分含量測(cè)定有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法分別考察流動(dòng)相比例變化±5％、流動(dòng)相pH值變化±0.2、柱溫變化±5℃、流速相對(duì)值變化±20％時(shí)，儀器色譜行為的變化，每個(gè)條件下各測(cè)試兩次。分別考察流動(dòng)相比例變化±5％、流動(dòng)相pH值變化±0.2、柱溫變化±5℃、檢測(cè)波長(zhǎng)變化±5nm、流速相對(duì)值變化±20％以及采用三根不同批號(hào)的色譜柱進(jìn)行測(cè)定時(shí)，儀器色譜行為的變化，每個(gè)條件下各測(cè)試兩次。接受標(biāo)準(zhǔn)主峰的拖尾因子不得大于2.0，主峰與雜質(zhì)峰必須達(dá)到基線分離；各條件下的含量數(shù)據(jù)（n=6）的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于2.0%。

各雜質(zhì)峰的拖尾因子不得大于2.0，雜質(zhì)峰與其他成分峰必須達(dá)到基線分離；各條件下的雜質(zhì)含量數(shù)據(jù)（n=6）的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于2.0%，雜質(zhì)含量的絕對(duì)值在±0.1％以內(nèi)。9系統(tǒng)適用性定義:是用來檢驗(yàn)所采用的測(cè)試條件能否達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求的條件，證明系統(tǒng)對(duì)于分析方法是適用的。——保證測(cè)試結(jié)果的可靠性 主要參數(shù):分離度、柱效、重復(fù)性、拖尾因子檢驗(yàn)項(xiàng)目主成分含量測(cè)定有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法與標(biāo)準(zhǔn)配制6份相同濃度的供試品溶液進(jìn)行分析，主峰峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于2.0%，主峰保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于1.0%。另外，主峰的拖尾因子不得大于2.0，主峰與雜質(zhì)峰必須達(dá)到基線分離，主峰的理論塔板數(shù)應(yīng)符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定。配制1份相同濃度的雜質(zhì)溶液進(jìn)行分析，各相鄰組分分離度不得小于1.5。另外，雜質(zhì)峰的拖尾因子不得大于2.0，理論塔板數(shù)應(yīng)符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定。10溶液穩(wěn)定性對(duì)照溶液:

室溫,冰箱冷藏/進(jìn)樣室溫度(2~8℃)供試溶液:室溫/進(jìn)樣室溫度(2~8℃)方法:與新制對(duì)照溶液比較——對(duì)照溶液穩(wěn)定性與初始測(cè)定結(jié)果比較——供試品溶液穩(wěn)定性檢驗(yàn)項(xiàng)目方法接受標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)物質(zhì)測(cè)定按照分析方法分別配置對(duì)照品溶液與供試品溶液，平行測(cè)定兩次主成分與雜質(zhì)的含量，然后將上述溶液分別貯存在室溫與冰箱冷藏室（4℃）中，在1、2、3、5和7天時(shí)分別平行測(cè)定兩次主成分與雜質(zhì)的含量。主成分的含量變化的絕對(duì)值應(yīng)不大于2.0%，雜質(zhì)含量的絕對(duì)值在±0.1％以內(nèi)，并不得出現(xiàn)新的大于報(bào)告限度的雜質(zhì)。分析方法再驗(yàn)證：在某些情況下，如原料藥合成工藝改變、制劑處方改變、分析方法發(fā)生部分改變等，均有必要對(duì)分析方法再次進(jìn)行全面或部分驗(yàn)證，以保證分析方法可靠，這一過程稱為方法再驗(yàn)證再驗(yàn)證原則：根據(jù)改變的程度進(jìn)行相應(yīng)的再驗(yàn)證。舉例：