谷草轉氨酶（ASTGOT）活性檢測試劑盒實驗解決方案

谷草轉氨酶（AST/GOT）活性檢測試劑盒實驗解決方案原理谷草轉氨酶（AST/GOT）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，催化可逆轉氨基反應，是氨基酸代謝的重要酶。血清AST活性水平是肝臟損傷的重要生化指標，可反映肝臟受損的嚴重程度。此外，AST在心肌細胞中含量最高，臨床上一般常作為心肌梗塞和心肌炎的輔助檢查。CheKine?谷草轉氨酶（AST/GOT）活性檢測試劑盒（微量法）提供了一種簡單的檢測方法檢測生物樣本如血清（漿）、動植物組織、細胞、細菌中谷草轉氨酶（AST/GOT）的活性水平。谷草轉氨酶（AST/GOT）在37℃及pH7.4條件下，催化α-酮戊二酸和L-天冬氨酸發(fā)生轉氨基反應，生成谷氨酸和丙酮酸；丙酮酸可與2,4-二硝基苯肼反應生成丙酮酸苯腙，在堿性條件下顯棕紅色，于505nm測定吸光度，即可計算AST/GOT酶活力。自備耗材·酶標儀或可見分光光度計（能測505nm處的吸光度）·水浴鍋、制冰機、低溫離心機·96孔板或微量玻璃比色皿、可調節(jié)式移液槍及槍頭·去離子水·勻漿器（如果是組織樣本）試劑準備Extraction

Buffer：即用型；使用前，平衡到室溫；-20℃保存。ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室溫；-20℃保存。ReagentⅡ：即用型；使用前，平衡到室溫；-20℃避光保存。ReagentⅢ：即用型；使用前，平衡到室溫；-20℃保存。Standard：即用型；使用前，平衡到室溫；-20℃保存。標準品準備：按下表混合Standard和ReagentⅠ，得到相應濃度的標準品。Standard（μL）ReagentⅠ（μL）Standard濃度（μmol/mL）1515112180.86240.43270.21.5529.250.050300注意：每次實驗，請使用新配制的標準品；配制好的標準品需要在4h之內使用。樣本制備注意：推薦使用新鮮樣本，如果不立即進行實驗，樣本可在-80℃保存1個月。動物組織：稱取約0.1g樣本，加入1mLExtractionBuffer，冰浴勻漿，8,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。植物組織：稱取約0.1g樣本，加入1mLExtractionBuffer搗碎，冰浴勻漿，8,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。細胞或細菌：收集500萬細胞或細菌到離心管內，用冷PBS清洗細胞，離心后棄上清，加入1mLExtractionBuffer，冰浴超聲波破碎細胞或細菌5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復30次），8,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。血清（漿）：直接測定。注意：如需樣本蛋白濃度測定，推薦使用AbbkineBCA法蛋白質定量試劑盒，貨號為KTD3001。該試劑盒提取的樣本也可以適用于KTB1410（谷丙轉氨酶）的測定。實驗步驟酶標儀或可見分光光度計預熱30min以上，調節(jié)波長至505nm，可見分光光度計用去離子水調零。在96孔板或微量玻璃比色皿中加入下列試劑：試劑測定孔（μL）對照孔（μL）標準孔（μL）樣本500ReagentⅠ25250不同濃度Std.0030混勻后，37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）預熱30minReagentⅡ252525樣本050混勻后，37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）準確反應20minReagentⅢ240240240混勻，室溫靜置10min，在505nm波長處測各孔的OD值，記為OD測定、OD對照、OD標準,計算ΔOD測定=OD測定-OD對照、ΔOD標準=OD標準-OD空白。注意：每個樣本均需要做對照孔。0μmol/mL標準孔為空白孔。實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。2.如果ΔOD測大于濃度為1.5μmol/mL標準品的ΔOD標，則需要用ExtractionBuffer稀釋樣本后，重新檢測。如果樣本的ΔOD測低于0.05μmol/mL標準品的ΔOD標，可提高樣本量。結果計算注意：我們?yōu)槟峁┑挠嬎愎?，包括推導過程計算公式和簡潔計算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計算公式為最終計算公式。標準曲線的繪制：以標準液濃度為y軸，ΔOD標準為x軸，繪制標準曲線。將ΔOD測定帶入方程計算出y（μmol/mL）。血清（漿）GOT的活性單位定義：每小時每mL血清樣品催化產生1μmol丙酮酸的量為一個GOT活力單位。GOT(U/mL)=y×(V樣本+VReagentⅠ)÷V樣本÷T=12y組織、細菌或細胞GOT的活性（1）按樣本蛋白濃度計算：單位定義：每小時每mg組織蛋白催化產生1μmol丙酮酸的量為一個GOT活力單位。GOT(U/mgprot)=y×(V樣本+VReagentⅠ)÷(Cpr×V樣本)÷T=12y÷Cpr注意：此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。（2）按樣本鮮重計算單位定義：每小時每g鮮重樣品催化產生1μmol丙酮酸的量為一個GOT活力單位。GOT(U/g鮮重)=y×(V樣本+VReagentⅠ)÷(W×V樣本÷V樣總)÷T=12y÷W（3）按細菌或細胞數(shù)量計算：單位定義：每小時每104個細菌或細胞催化產生1μmol丙酮酸的量為一個GOT活力單位。GOT(U/104)=y×(V樣本+VReagentⅠ)÷(500÷V樣本÷V樣總)÷T=0.024yV樣本：樣本體積，0.005mL；VReagentⅠ：加入RegentⅠ體積，0.025mL；V樣總：ExtractionBuffer體積，1mL；W：樣本鮮重，g；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；T：反應時間，0.5h；500：細菌或細胞總數(shù)量，500萬個。結果展示