過氧化氫（H2O2）含量檢測試劑盒實驗解決方案

過氧化氫（H2O2）含量檢測試劑盒實驗解決方案原理過氧化氫（H2O2）是生物體內(nèi)最常見的活性氧分子，是一種活性氧代謝的副產(chǎn)物，主要由SOD和XOD等催化產(chǎn)生，由CAT和POD等催化降解。過氧化氫不僅是重要的活性氧之一，也是活性氧相互轉(zhuǎn)化的樞紐。一方面，H2O2可以直接或間接地氧化細胞內(nèi)核酸，蛋白質(zhì)等生物大分子，使細胞膜遭受損害，從而加速細胞的衰老和解體；另一方面，過氧化氫也是許多氧化應(yīng)急反應(yīng)中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。過氧化氫可以激活NF-κB等因子，這些過氧化氫相關(guān)的信號途徑和哮喘、炎癥性關(guān)節(jié)炎、動脈硬化以及神經(jīng)退行性疾病等許多疾病相關(guān)。過氧化氫也和細胞凋亡、細胞增殖等密切相關(guān)。CheKine?過氧化氫（H2O2）含量檢測試劑盒（微量法），提供了一種簡單易用的方法，用于測量血清、血漿、細胞、組織和其它生物液體中H2O2含量。試劑盒利用過氧化氫氧化二價鐵離子產(chǎn)生三價鐵離子，然后和xylenolorange（二甲酚橙）在特定的溶液中形成紫色的產(chǎn)物，在580nm的OD值與過氧化氫濃度成正比，從而實現(xiàn)對過氧化氫濃度的測定。自備耗材·酶標儀或可見分光光度計（能測580nm處的吸光度）及水浴鍋·96孔板或微量玻璃比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭·離心機·去離子水·勻漿器（如果是組織樣本）·10kDa的超濾管或30%ZnSO4溶液（用來去除蛋白）試劑準備ReactionBuffer：即用型；使用前，平衡到室溫；整個實驗過程中，避光放置；建議分裝保存在-20℃避光保存。H2O2Standard(1M)：即用型；使用前，平衡到室溫；整個實驗過程中，避光放置；建議分裝保存在-20℃避光保存。AssayBuffer(1×):使用前，平衡到室溫；AssayBuffer(10×)用去離子水1:10稀釋后作為工作液。AssayBuffer(1×)可在4℃保存至少2個月，并用來稀釋H2O2標準品和樣本。標準品制備：先配制2mMH2O2Standard：2μL1M的H2O2Standard用998μL的AssayBuffer(1×)稀釋；再配制100μMH2O2Standard：50μL2mM的H2O2Standard用950μL的AssayBuffer(1×)稀釋。配制好的標準品需要在4h之內(nèi)使用。100μMH2O2Standard，按照下表所示，進一步稀釋標準品。序號100μMStandard（μL）AssayBuffer(1×)（μL）Concentration（μM）Std.12000100Std.210010050Std.34016020Std.42018010Std.5101905Std.641962Std.721981Blank02000注意：每次實驗，請使用新配制的標準品；配制好的標準品需要在4h之內(nèi)使用；如果樣本是細胞懸浮液，建議使用培養(yǎng)基配制H2O2標準品。樣本制備動物組織：用冷的PBS清洗組織，盡可能去除血液。吸干組織上的水分，稱取0.1g，加入1mL預(yù)冷的AssayBuffer(1×)，將樣本冰上進行勻漿。10,000g，4℃離心5min，取上清液做進一步分析。植物組織：稱取約0.1g樣本，加入1mL預(yù)冷的AssayBuffer(1×)搗碎，冰浴超聲波破碎5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復(fù)30次），10,000g，4℃離心5min，取上清液，置冰上待測。細胞和細菌樣本的制備：收集5×106個細胞或細菌，用冷PBS清洗細胞或細菌后，加入1mL預(yù)冷的AssayBuffer(1×)冰上進行勻漿或冰浴超聲波破碎5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復(fù)30次）。10,000g，4℃離心5min，取上清液做進一步分析。血清、血漿、尿液（和其它生物學(xué)液體）：去除蛋白后，取上清。去除蛋白的方式：可使用10kDa的超濾管過濾后取濾液或是將樣本：30%ZnSO4溶液=20:1進行混合后渦旋，再10,000g室溫離心5min，取上清。注意：建議使用新鮮樣本。如果不能馬上進行該項實驗，建議將樣本儲存在-80℃保存1個月。當準備好進行該項實驗時，將樣本從-80℃拿出后，冰上解凍，但是請注意，這可能會影響樣本的穩(wěn)定性，實驗結(jié)果可能會低于預(yù)期；如下物質(zhì)會干擾檢測結(jié)果，樣本中應(yīng)避免存在：Ferricsalts,ironsalts,sucrose,glucose,ascorbicacid,SDS(>0.2%),sodiumazide。該試劑盒提取的樣本也可以適用于KTB1500的測定。實驗步驟酶標儀或可見分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到580nm，可見分光光度計用去離子水調(diào)零。在96孔板或微量玻璃比色皿中按照如下方式加樣：試劑標準孔（μL）測定孔（μL）不同濃度Stds.600樣本060ReactionBuffer4040充分混勻，37℃孵育10min，讀取580nm處的吸光值，記為A空、A標、A測，計算ΔA標=A標-A空、ΔA測=A測-A空。注意：1.Std.Blank即為空白孔。實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。2.如果ΔA測大于濃度為100μM標準品的ΔA標，則需要用AssayBuffer(1×)稀釋樣本后，重新檢測。如果樣本的ΔA測低于0.005，可提高樣本量。結(jié)果計算標準曲線的繪制以標準液濃度為y軸，ΔA標為x軸，繪制標準曲線。樣本H2O2濃度計算將ΔA測代入公式計算出y(1μM=1nmol/mL)。按樣本鮮重計算H2O2含量(nmol/g鮮重)=y×V樣÷(W×V樣÷V樣總)×n=y÷W×n按樣本體積計算H2O2含量(nmol/mL)=y×V樣÷V樣×n=y×n按細胞或細菌數(shù)量計算H2O2含量(nmol/104)=y×V樣÷(細胞或細菌數(shù)量×V樣÷V樣總)×n=y÷500×nV樣：加入樣本體積，0.025mL；W：樣本質(zhì)量，g；V樣總：加入AssayBuffer(1×)體積，1mL；n：樣本稀釋倍數(shù)；500：細胞或細菌總數(shù)，500萬。結(jié)果展示以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實驗者需根據(jù)自己的實驗建立標準曲線[HydrogenPeroxide][HydrogenPeroxide],μMΔAΔA標Figure1.H2O2標準曲線相