（高清版）DB37∕T 3104-2018 向日葵雜交種品種純度SSR分子檢測標準

DB37/T3104—2018向日葵雜交種品種純度SSR分子檢測標準2018-02-02發(fā)布2018-03-02實施山東省質(zhì)量技術監(jiān)督局發(fā)布IDB37/T3104—2018本標準按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標準由山東省農(nóng)業(yè)廳提出。本標準由山東省農(nóng)業(yè)標準化技術委員會歸口。本標準主要起草單位：山東農(nóng)業(yè)大學、北京德農(nóng)種業(yè)有限公司。本標準起草人：張春慶、趙洪春、鄭建鵬、溫大興、李巖。本標準為首次發(fā)布。1DB37/T3104—2018向日葵雜交種品種純度SSR分子檢測標準產(chǎn)物檢測等技術要求。本規(guī)程適用于向日葵品種和雜交種種子純度的室內(nèi)快速鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB3543種子檢驗技術規(guī)程GB20464農(nóng)作物種子標簽通則3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。雜交種各種直接用于生產(chǎn)的雜交向日葵一代種子。品種純度品種在特征特性方面典型一致的程度，用本品種的種子數(shù)占供檢本作物樣品種子數(shù)的百分率表示。標準樣品能夠充分代表種或品種特征特性的種子樣品，或具備指定特征、特性樣品。引物的互補鏈。4原理2DB37/T3104—2018從向日葵種子中提取DNA,利用SSR引物進行PCR擴增，不同堿基長度的PCR擴增引物通過聚丙烯酰胺分，從而對不同品種進行鑒定。雜交種純度鑒定時，可從附表中選取親本有差異的SSR引物。品種純度鑒定時，從附表中選擇生產(chǎn)上常用品種間有差異的引物。5儀器與試劑5.2試劑氫氧化鈉、氫氧化鉀、甲醛、2×PowerTaqPCRMasterMix、超純水、SSR引物、硝酸銀(所用試劑均為分析純，所用水均為去離子水)。6溶液6.230%凝膠溶液稱取292g丙烯酰胺于1000mL燒杯中，加去離子水溶解，再加入8g甲叉雙丙烯酰胺，溶解后定容6.4催化劑6.6染色液6.7顯色液3DB37/T3104—2018從送驗樣品中隨機數(shù)取向日葵種子200粒，將種子剝殼后縱切，放入1.5mL離心管中，加入300μL提取液，提取時間1min~24h均可，使用前混勻、靜止5分鐘、離心3000rpm,0.5min,取上清即為0.2μL5U/μLTaq酶，2μL10×PCRBuffer,2μLDNA提取液，用滅7.3多重PCR擴增程序a)預變性(94℃,5min);b)第一段循環(huán)(循環(huán)數(shù)：3)命名為“逐一退火循環(huán)”:變性(94℃,40s);按照未加通用接頭前的多對引物的退火溫度從高到低的順序逐一退火，每個退火溫度的退火時間為20s;延伸(72℃,30s);c)第二段循環(huán)(循環(huán)數(shù)：28～32,通常為30個循環(huán)):變性(94℃,40s);將退火和延伸過程合并(70℃,50s);d)終延伸(72℃,10min)。引物選擇參考附表，每個雜交種選擇3~5對親本有差異的引物擴增。7.4擴增產(chǎn)物檢測可用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，也可用高通量檢測設備，對PCR產(chǎn)物進行檢測。聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測程序如下。將洗凈晾干的玻璃板采用水平平板灌膠的方式組裝玻璃板，用鐵夾固定，取20mL5×TBE,30mL30%Acr,50mL去離子水于燒杯中，加800uL～1000uL的10%APS,80uL~100uLTEMED混勻，灌入板中，插入梳子，10min左右聚合，拔出梳子，吸取多余的水，裝板。用微量移液器取2ul體系加入樣品槽，每加一個樣品后，清洗移液器兩次，區(qū)分不同引物加marker。加樣完畢后，加入電極緩沖液，上槽電極緩沖液要沒過矮玻璃板，下槽電極緩沖液要沒過玻璃板，將電源線正極接下槽，負極接上槽。接通電源，180V穩(wěn)壓電泳2.5h。倒出電極液，卸開電泳槽并用油灰刀取出膠片，將膠放入去離子水中水平搖床1min,倒掉去離子水，加入染色液硝酸銀，水平搖床2min~3min,倒掉，加入去離子，水水平搖床1min,倒掉，加入顯色液500ml(2%氫氧化鈉，用時加入甲醛2ml),水平搖床至顯色為止，倒掉顯色液，加入去離子7.4.5譜帶分析4DB37/T31042018待整個供檢樣品電泳結(jié)束后，鑒定凝膠膠片上電泳譜帶的一致性。對檢測的SSR引物雙親譜帶同時出現(xiàn)的為本品種，只有某一親本譜帶為親本，譜帶與雙親位置有差異的籽粒為雜粒。計數(shù)供檢樣品粒數(shù)(N)和非本品種粒數(shù)(M),并按式計算電泳測定值X%(保留一位小數(shù))。X(%)=(N-M)/N×100按照GB/T3543,寫明對照樣品名稱，使用的親本有差異的引物數(shù)量，檢測粒數(shù)，純度%。對送樣樣品的檢驗需注明：“結(jié)果僅對樣品負責”;監(jiān)督檢驗時，需注明：“結(jié)果對種子批負責”。5DB37/T3104—2018(規(guī)范性附錄)引物及其參數(shù)表A.1規(guī)定了標準中引物及其參數(shù)。引物名稱序列(5'to3')Tm退火溫度ORS928-FCATGGTTATTTTGGTTTGGGTTTORS928-RGCTATTATCATGTCCTTGTCCTTTTORS613-FGTAAACCCTAGGTCAATTTGCAG55(+2、+1)ORS613-RATCTCCGGAAAACATTCTCGORS543-FCCAAGTTTCAGTTACAATCCATGAORS543-RGGTCATTAGGAGTTTGGGATCAORS694-FCCTGGAACTGAACCGAGAAC59(-1、+1、+2)ORS694-RGCCGTGAAACAGAGAGAGGAORS956-FGGACCAGATTGCTTCCTAGACTT60.2ORS956-RTCAACATGCGTGATTATTGTTTGORS483-FCCGAACAACAATCTCCACAAORS483-RGGTTTAGGTGTCGCATCACAORS925-FATGATTCTAAGTTGCGGTAGTGCORS925-RGTTGGGTTTAAGTTGTTGCTTCCORS1025-FGACATGGCTTGAACATTTGATTAORS1025-RTCTTATATGCACATCAGTACAAGTCTCORS1021-FAACCCTAATCCAACCAGATACGAORS1021-RTACCACCAGCTCATCCTTAACCT60.2ORS1079-FTACGACTGACGATTCCATTTCTCORS1079-RAACTGGATTTCACAGGGAGTGTTORS1256-FGATGTTGATGTTGGTGAAGTTGCORS1256-RCTCCGTCACCTTAAGCACTTGTA60.2ORS409-FTCCCAGACTAGAGATCGACCA60.0ORS409-RAAACTCAAGGGACTAAGGTTGCORS1108-FACCACACTTATCCAAAGGTTTAAGG58(-1)ORS1108-RCGTGAGAGTAGTTACGAGAAGGAGA62.06DB37/T3104—2018引物名稱序列(5'to3')退火溫度ORS727-FGGTGGCAAGTGGTGGTTAGAORS727-RAAAGCTGGTCATCTCAAGGGTAORS801-FCCATCTTGGACGCACATCTAORS801-RGAACCACCCGATCATATCCAORS366-FAACCAACTGAGCATTCTTGTGAORS366-RGCGCTAGGTTAAAGAGGACAAAORS331-FTGAAGAAGGGTTGTTGATTACAAGORS331-RGCATTGGGTTCACCATTTCTORS1065-FACCGCTGTCAACACCTTAAACTC60.259(-1)ORS1065-RGGCTGGGAATCAACTGCTACTAC62.0ORS885-FAATGTAAGCCAGAATCCCAAATGORS885-RCCTTCGTCGTTTCCAAGTAGATTORS1088-FACTATCGAACCTCCCTCCAAAC60.1ORS1088-RGGATTTCTTTCATCTTTGTGGTGORS1141-FCGCATATGGGAACGTATACACAC60.256(-1)ORS1141-RTGAAACTGAACACAAGGCATACAORS565-FTGGTCAACGGATTTAGAGTCAAORS565-RTCCAGTTTGGTCTTGATTTGGORS621-FCGCCTTATGCTGAGAGGAAAORS621-RCCTGAAGCGAAGAAGAATCGORS785-FCAAAATACCCAGGTCAAAGCA55(+2)ORS785-RCCTAGCTTATGGGACGTATGGA60.1ORS1242-FGCAATCGTTTCACTCTTCCATTCORS1242-RTGGTCGTAGAATTGTCGGTCATORS1036-FCCCTTTCACTTCCTATTTTCTATTCA56(+2、+1)ORS1036-RCTAAGAGGGGTCGGTATGATTTC60.2ORS512-FCACTCTTGATTAATCACAGTATCTTGCORS512-RGCAGGGACCAATGTTGTCATAORS78-FGTTCGTCGAGTACATGTTCTGC60.1ORS78-RTTTCCCTCTGGAAAGTTGTCAORS844-FACGATGCAAAGAATATACTGCACORS844-RCATGTTTAATAGGTTTTAATTCTAGGGORS695-FTCACCTCATTCTTCACTTTCCAORS695-RTTGGTGGTGGCAGCTATGTAORS537-FTTCTCCCCAAAAACATTCCAORS537-RAAAGAGGAGGCTTGATGATGA7DB37/T3104—2018表A.1引物及其參數(shù)(續(xù))引物名稱序列(5'to3')Tm退火溫度ORS70-FGACCCTGGTCACCGAAGTTA54(-1)ORS70-RATCTGAAATCGGACAAGATTCAORS505-FGTGCGTTGGCTCTTATGGATORS505-RAGTGATGGCATTCCCAATTTORS456-FCCAAGGAATTCTAACAAGAGTTTAAGORS456-RGATTTCTCACTTCACTCCTCTATGC60.3ORS966-FTCAAAGATGTCACCATAGGAAAGAORS966-RATTTGCTGAGACCATGAGCATCORS946-FCAAAACCAGCCATCTATCTCTCTTC60.3ORS946-RTTTGTGGGTCTCTCTCTACAAGGTT60.3ORS716-FCCCCACAACCCATAGCCTAAORS716-RGAACTAACCGCCATCCAAGAORS316-FTGGCGTCTTCATAGCATCAGORS316-RGAGATTTGAGCTTCGTGTTGCORS938-FACCAACTCCCATGCAACCTAAORS938-RGCGTTCTCACCGTTCTAACACTT60.2ORS381-FCCAACGGTGATGTAACTAGGAAORS381-RGTTCTCCTGGATAGCTCGACA60.0ORS1073-FAGAGTGTTGGTCTTGATTTGTGGORS1073-RAAAGAAAGGCGCACGTTAGTCORS965-FTTGGATTACCTTGGATAGTCAGCORS965-RCTTACCCTCCTCAGACCCTACCT63.7ORS12-FGCTTTGAGAAACCGCTTCACORS12-RTTGATATGGTAACTAACGAACACAAORS836-FCACGAAATCGTTCCATTATTATGTTORS836-RGCAAGATAGTTTGATCAGGTAGCAAORS561-FCTTTGCACGTTGGTCATCATORS561-RACCAGCACCTTCCTCAACTGORS595-FTGATGGTAATGCATCGGGTAORS595-RCACACCATCCCTTGTAAAATCAORS725-FTCCGACGACCAAAGAAACTTORS725-RCACAATGAAGGGAAATGGAGAORS1064-FTGAATGATCTATGAGTGGTGATGGORS1064-RACTCGCAGTGGTAAGTCGTTAGG62.0ORS899-FGCCACGTATAACTGACTATGACCA60.3ORS899-RCGAATACAGACTCGATAAACGACAORS1120-FTAACGTGTGCAGGTCTGTCTAAAORS1120-RTGCAAATAATAAGATAATGACCGATT8DB37/T3104—2018表A.1引物及其參數(shù)(續(xù))引物名稱序列(5'to3')Tm退火溫度ORS665-FGCACATGAGGTATGGATCTCCT60.1ORS665-RTGCAAATACAACTCGGGAAAORS420-FTCATGGTGTTTGGTTTGTGTCORS420-RTGCCAAATTCCTCTTCTTTCTORS432-FTGGACCAGTCGTAATCTTTGCORS432-RAAACGCATGCAAATGAGGATORS1086-FTTGTTTGTCGCACACTCAAGATTORS1086-RATTATCGGCACATCTTTGGATTTORS610-FTTGTGACCTTCTCCCTGCTCORS610-RAGGAAGCGAAACGAGGAAGTORS878-FTGCAAGGTATCCATATTCCACAAORS878-RTATACGCACCGGAAAGAAAGTCORS530-FCACTTCATCCTCTCCCTCCTT60.0ORS530-RGGCGTGTGTGTTGGGTTATTORS795-FCGCTAGTTACACCGCAGATGORS795-RTGTCCACAGGTTGAAGATCGORS503-FTGAACCTTCAAACTTGCAATCAORS503-RAAACACACAACACAGGCAAGAORS644-FTCTGCGATACACACATCCAAAORS644-RGGGCTGTTAAAGGTGAGATTCAAORS588-FCGGTTCTCTTTCTCACCTCAAORS588-RTCTCCCGTTCGGACTTCTCORS1178-FAGCTGACCATGTAAGGTTTGGTTORS1178-RATTGTTGAGAGACGAGATGGATGORS691-FGCATCTGAGCAACTGCGTTAORS691-RACCGTCCTTAGCTCTTGTGAG60.0ORS552-FCCATCCCTTCCCTCTCTTTCORS552-RGTGGCTGGAATCTCATCACCORS1187-FAAAGATGTCAGTTTGTCCGTGTCORS1187-RCATCCACATTTCCCTTACACTCAORS1245-FGAAGTGGAGCAATGTTGGTGAORS1245-RCGCCAAGATATTAGTGTGATGATTORS1114-FAGATGGTGGCAGGAGAGTTAAAG60.2ORS1114-RGCAGAAACAGATCAGGAGGGTAT60.2ORS733-FTATGAGTTGGCAAGGGCTTCORS733-RGGACTCCAACGAGAGAATCAGT60.1ORS10-FCTCCACCACACAATCTCCGORS10-RTGTGGAGTTTGCCAGAACTG9DB37/T3104—2018表A.1引物及其參數(shù)(續(xù))引物名稱序列(5'to3')Tm退火溫度ORS340-FGGGCATAGTTTCCTCCGTTTORS340-RAAGTTCTCACGGTTCTTACAACTCORS1146-FGGCTCATCACTTGCATCTATTGTORS1146-RTGAAGACACCATCTCCAATGCORS397-FCAAAGTCCCAAACCACAACCORS397-RGGGAAACAAGTTCCTTGATGGORS995-FCATGCTTTCTAGGATGGTCAGTTORS995-RTGTATGTGGAGGCCAACAAGTATORS799-FTCCAGCAAGTCAGCAACAACORS799-RACTCCCTCCCATTCTCGTCTORS386-FTCCAGTTATCCAAAGGTGTGCORS386-RGTGCTAGAAGAACCTGTAACCATTORS1237-FTTCCAGAAATTGGAGAGCAAA53(+1)ORS1237-RGATTCTTAGCAAACGCAGAGGORS342-FTGTTCATCAGGTTTGTCTCCAORS342-RCACCAGCATAGCCATTCAAAORS351-FTGAAACGTAGTAACCTGCCAAAORS351-RTTGGACGACCTCGGTATCTTORS547-FTTGTCTTCATCTGCGTGTGAORS547-RTTGCTGTTGTTGATCGGTGTORS677-FTCCTTCCTTCATTCTCTGCATTORS677-RCTCCATACCGTTGCCATCATORS1179-FGATTCGGAGCTGTTAGGAGGTAG62.0ORS1179-RAAACGGGAAGCAAGAATAGAACAORS510-FCATCGCGTCCCTCTCTCTAA57(-1)ORS510-RCCAACCATCACAGCAATCAGORS911-FAAGGATCACTGGAAGAACAATGG57(-1)ORS911-RTAAACGCTTGTGACGGTTAGTTGORS423-FTCATATGGAGGGATCTGTTGG54(-1)ORS423-RAAGCAACCATAATGCATCAGAAORS4-FACAAGTCGGCTGGTGAGCORS4-RACATGAAACACGAGCTAAACCORS810-FTTCAACGTGCGTGATTAAGGORS810-RGCGATTTCTTTGGAGACGAAORS57-FTTCCATTTCCACCATTTTGGCORS57-RCATTCATGGCCTAAAAGGTTCORS1030-FCCTTTGATGTAG