甲醛脫氫酶（FDH）活性檢測試劑盒實驗解決方案

甲醛脫氫酶（FDH）活性檢測試劑盒實驗解決方案原理甲醛是一種能與蛋白質(zhì)、核酸和脂類產(chǎn)生非特異性反應(yīng)的活潑化合物，對所有生物都具有很高毒性。甲醛脫氫酶（FDH）作為含鋅中等鏈醇脫氫酶（ADH）的家庭成員之一，廣泛存在于原核和真核生物中，該酶能利用NAD+作為輔酶，將有毒的甲醛氧化，是甲醛氧化途徑中的關(guān)鍵酶。FDH催化甲醛和NAD+產(chǎn)生NADH，在340nm處的吸光值會增加，測定340nm處的吸光值變化，可計算得到FDH的活性。自備耗材·酶標儀或紫外分光光度計（能測340nm處的吸光度）·96孔UV板或微量石英比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭·恒溫水浴鍋、制冰機、離心機·去離子水·勻漿器（如果是組織樣本）試劑準備ExtractionBuffer：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃保存。ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃保存。ReagentⅡ：臨用前配制；48T加入3mL去離子水，96T加入6mL去離子水，充分溶解待用。用不完的試劑-20℃分裝保存一個月。ReagentⅢ：臨用前配制；48T加入0.75mL去離子水，96T加入1.5mL去離子水，充分溶解待用。用不完的試劑4℃避光可保存一個月。ReagentⅣ：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃避光保存。注意：ReagentⅣ有刺激性氣味，建議在通風(fēng)櫥進行實驗。樣本制備注意：推薦使用新鮮樣本，如果不立即進行實驗，樣本可在-80℃保存1個月。測定時，應(yīng)控制解凍的溫度和時間。室溫環(huán)境下解凍時，需在4h內(nèi)完成樣品解凍。組織：稱取約0.1g樣本，加入1mLExtractionBuffer，冰浴勻漿，10,000g，4℃離心20min，取上清液，置冰上待測。細胞：收集500萬細胞到離心管內(nèi)，用冷PBS清洗細胞，離心后棄上清，加入1mLExtractionBuffer，冰浴超聲波破碎細胞3min（功率300W，超聲3s，間隔7s，總時間3min），然后10,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。血清（漿）等液體樣本：直接測定。若溶液有渾濁則離心后取上清進行測定。注意：如需測定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號：KTD3001的蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA法）進行樣本蛋白質(zhì)濃度測定。實驗步驟酶標儀或紫外分光光度計預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長到340nm。紫外分光光度計用去離子水調(diào)零。操作表（下述操作在96孔UV板或微量石英比色皿中進行）：試劑測定孔（μL）樣本20ReagentⅠ110ReagentII50ReagentIII10ReagentIV10充分混勻，于340nm處測定初始吸光值A(chǔ)1與30min后的吸光值A(chǔ)2，計算ΔA=A2-A1。注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗，若樣本數(shù)量較多，可將試劑按比例配成工作液使用。如果ΔA小于0.01可適當加大樣本量或適當延長反應(yīng)時間（比如反應(yīng)60min）。如果ΔA大于1.0，樣本可用ExtractionBuffer進一步稀釋，計算結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)，或減少提取用樣本量。結(jié)果計算注意：我們?yōu)槟峁┑挠嬎愎?，包括推?dǎo)過程計算公式和簡潔計算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計算公式為最終計算公式。使用96孔UV板測定的計算公式如下（1）按樣本蛋白濃度計算：酶活單位定義：每mg蛋白每分鐘催化生成1nmolNADH的酶量為1個酶活單位。FDH(U/mgprot)=ΔA÷(ε×d)×V反總÷(V樣×Cpr)÷T=128.6×ΔA÷Cpr（2）按樣本質(zhì)量計算:酶活定義：每g樣品每分鐘催化生成1nmolNADH的酶量為1個酶活單位。FDH(U/g鮮重)=ΔA÷(ε×d)×V反總÷(V樣×W÷V樣總)÷T=128.6×ΔA÷W（3）按照細胞數(shù)量計算:酶活定義：每104個細胞每分鐘催化生成1nmolNADH的酶量為1個酶活單位。FDH(U/104cell)=ΔA÷(ε×d)×V反總÷(V樣×500÷V樣總)÷T=128.6×ΔA÷500（4）按液體體積計算:酶活定義：每mL樣本每分鐘催化生成1nmolNADH的酶量為1個酶活單位。FDH(U/mL)=ΔA÷(ε×d)×V反總÷V樣÷T=128.6×ΔAε：NADH微摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：96孔UV板光徑，0.5cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL；V樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.02mL；V樣總：加入ExtractionBuffer體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，30min；500：細胞總數(shù)，5×106。使用微量石英比色皿測定的計算公式將上述計算公式中光徑d:0.5cm調(diào)整為d:1cm進行計算即可。注意事項ReagentIV有毒性，實驗時請佩戴口罩手套等防護措施。結(jié)果展示Figure1.本試劑盒測定小鼠肝臟