滅菌方法與生物指示劑省公開課一等獎(jiǎng)全國(guó)示范課微課金獎(jiǎng)?wù)n件

上海漢尼生物技術(shù)有限企業(yè)李燕燕產(chǎn)品經(jīng)理

滅菌方法與生物指示劑1/43概要滅菌法和生物指示劑生物指示劑形式無(wú)菌確保水平滅菌工藝驗(yàn)證慣用滅菌方法制藥工業(yè)慣用滅菌方法生物指示劑使用孢子數(shù)測(cè)定

2/43滅菌法和生物指示劑

滅菌法系指用適當(dāng)物理或化學(xué)伎倆將物品中活微生物殺滅或除去，從而使物品殘余活微生物概率下降至預(yù)期無(wú)菌確保水平方法。

生物指示劑系一類特殊活微生物制品，可用于確認(rèn)滅菌設(shè)備性能、滅菌程序驗(yàn)證、生產(chǎn)過(guò)程滅菌效果監(jiān)控等。用于滅菌驗(yàn)證中生物指示劑普通是細(xì)菌孢子。3/43生物指示劑形式一定數(shù)量孢子附著在惰性載體上，如濾紙條、玻片、不銹鋼、塑料制品等孢子懸浮液密封于安瓿中

4/43無(wú)菌確保水平

無(wú)菌確保水平一批物品無(wú)菌特征只能相對(duì)地經(jīng)過(guò)物品中活微生物概率低至某個(gè)可接收水平來(lái)表述，即SAL（sterilityassurancelevel）。我國(guó)及歐美藥典都把SAL不得大于百萬(wàn)分之一作為最終滅菌產(chǎn)品無(wú)菌確保要求，即SAL≤10－6

5/43滅菌工藝驗(yàn)證驗(yàn)證一個(gè)滅菌工藝系統(tǒng)能否使產(chǎn)品滅菌后到達(dá)無(wú)菌要求,通常認(rèn)為滅菌后微生物殘余概率小于1×10-6。物理性驗(yàn)證：經(jīng)過(guò)得到熱分布與熱穿透數(shù)據(jù),來(lái)估測(cè)一個(gè)滅菌程序?qū)ξ⑸镏滤佬?。化學(xué)指示劑驗(yàn)證：物品包外用化學(xué)指示劑用于驗(yàn)證物品是否經(jīng)過(guò)滅菌處理，物品包內(nèi)中心部位化學(xué)指示劑才可作為物品是否到達(dá)滅菌參考標(biāo)志。生物指示劑驗(yàn)證：將已知其耐熱性生物指示劑直接接種在產(chǎn)品溶液或相同溶液中進(jìn)行驗(yàn)證,是評(píng)判滅菌工藝殺滅效果最直觀有效方法,也是滅菌工藝驗(yàn)證必不可少試驗(yàn)。6/43慣用滅菌方法濕熱滅菌法干熱滅菌法氣體滅菌法輻射滅菌法過(guò)濾除菌法7/43不一樣滅菌方式不一樣菌種種類選擇滅菌方法生物指示劑保藏號(hào)D值備注濕熱滅菌法嗜熱脂肪芽孢桿菌BacillusstearothermophilusNCTC10007NCIMB8157ATCC79531.5-3.0min生孢梭菌孢子ClostridiumsporogenesNCTC8594NCIMB8053ATCC79550.4-0.8min干熱滅菌法枯草芽孢桿菌BacillussubtilisNCIMB8058ATCC9372>1.5min去熱原驗(yàn)證時(shí)加大腸桿菌內(nèi)毒素(Escherichiacoliendoxin)輻射滅菌法短小芽孢桿菌BacilluspumilusNCTC10327NCIMB10692ATCC271423kGy短小芽孢桿菌孢子可用于監(jiān)控滅菌過(guò)程，但不能用于滅菌輻射劑量建立氣體滅菌法枯草芽孢桿菌BacillussubtilisNCTC10073ATCC9372>2.5min環(huán)氧乙烷滅菌嗜熱脂肪芽孢桿菌BacillusstearothermophilusNCTC10007NCIMB8157ATCC795312980氣態(tài)過(guò)氧化氫滅菌過(guò)濾除菌法缺點(diǎn)假單胞菌PseudomonasdiminutaATCC19146用于濾膜孔徑為0.22μm濾器黏質(zhì)沙雷菌Serratin

marcescensATCC14756用于濾膜孔徑為0.45μm濾器8/43濕熱滅菌法

指將物品置于滅菌柜內(nèi)利用高壓飽和蒸汽、過(guò)熱水噴淋等伎倆使微生物菌體中蛋白質(zhì)、核酸發(fā)生變性而殺滅微生物方法。

須確保物品滅菌后SAL≤10-6對(duì)熱穩(wěn)定物品，可采取過(guò)分殺滅法，其SAL應(yīng)≤10-12

9/43適用范圍

藥品、容器、培養(yǎng)基、無(wú)菌衣、膠塞以及其它遇高溫和潮濕不發(fā)生改變或損壞物品10/43慣用生物指示劑嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子(SporesofBacillusstearothermophilus，NCTC10007、NCIMB8157、ATCC7953)D值為1.5～3.0min生孢梭菌孢子(SporesofClostridiumsporogenes，NCTC8594、NCIMB8053、ATCC7955

）

D值為0.4～0.8min11/43生物指示劑選擇12/43干熱滅菌法

指物品于干熱滅菌柜、隧道滅菌器等設(shè)備中，利用干熱空氣到達(dá)殺滅微生物或消除熱原物質(zhì)方法。

確保滅菌后產(chǎn)品其SAL≤10-6干熱過(guò)分殺滅后產(chǎn)品SAL應(yīng)≤10-12

13/43

耐高溫但不宜用濕熱滅菌法滅菌物品滅菌，如玻璃器具、金屬制容器、纖維制品、固體試藥、液狀石蠟等

適用范圍14/43枯草芽孢桿菌孢子(SporesofBacillussubtilis，NCIMB8058、ATCC9372)

慣用生物指示劑

D值大于1.5min

15/43生物指示劑選擇16/43氣體滅菌法

指用化學(xué)消毒劑形成氣體殺滅微生物方法。在充有滅菌氣體高壓腔室內(nèi)進(jìn)行。

慣用氣體：環(huán)氧乙烷、氣態(tài)過(guò)氧化氫、甲醛等

17/43環(huán)氧乙烷法滅菌原理：強(qiáng)氧化，其分子作用于菌體后，能與菌體蛋白、核酸和酶中—COOH、—NH2、—SH、—OH等基團(tuán)起反應(yīng)，而使菌體死亡。

含有殺菌譜廣，滅菌能力強(qiáng)特點(diǎn)，對(duì)微生物繁殖體、芽孢有較強(qiáng)殺滅效果。

18/43適用范圍塑料包裝原料粉末、散劑、顆粒等固體藥料及醫(yī)療器械類固體器具等不能采取高溫滅菌物品滅菌含氯物品及能吸附環(huán)氧乙烷物品則不宜使用19/43慣用生物指示劑枯草芽孢桿菌孢子(SporesofBacillussubtilis，NCTC10073、NCIMB8058、ATCC9372)

D值大于2.5min

20/43氣態(tài)過(guò)氧化氫法是利用過(guò)氧化氫在低濃度氣體狀態(tài)下比液體狀態(tài)更具殺孢子能力優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)生成游離-OH，用于進(jìn)攻細(xì)胞成份，包含脂類、蛋白質(zhì)和DNA，到達(dá)完全滅菌要求一個(gè)技術(shù)。21/43應(yīng)用：

隔離器驗(yàn)證

新設(shè)備或灌裝線調(diào)整和認(rèn)證大型或組裝設(shè)備評(píng)定未知?dú)怏w分布動(dòng)力學(xué)研究含有多個(gè)裝載配置設(shè)備認(rèn)證設(shè)備中最難滅菌位置日常檢測(cè)

生物指示劑：嗜熱脂肪芽胞桿菌孢子(SporesofBacillusstearothermophilus，NCTC10007、NCIMB8157、ATCC7953)22/43生物指示劑選擇23/43輻射滅菌法

應(yīng)用γ射線、β射線殺滅細(xì)菌方法，又稱電離輻射，前者由鈷-60或銫-137發(fā)出，穿透力強(qiáng)；后者由電子加速器產(chǎn)生，帶電荷，穿透力弱，滅菌效果差。γ射線滅菌機(jī)理：γ射線直接作用于微生物蛋白質(zhì)、核酸和酶等，促使化學(xué)鍵斷裂，殺死微生物；又可間接作用于微生物體內(nèi)水分子，引發(fā)水電離和激發(fā)，生成自由基，再作用于微生物活性分子，使微生物死亡。對(duì)于輻射滅菌，無(wú)芽孢菌比有芽孢菌敏感得多；無(wú)芽孢菌中革蘭氏陰性菌比陽(yáng)性菌敏感；而病毒敏感性很差。

24/43適用范圍

不耐熱藥品滅菌，醫(yī)療器械、容器、高分子材料、包裝材料、生產(chǎn)輔助用具、不受輻射破壞原料藥及成品等均可用本法滅菌。

25/43慣用生物指示劑

短小芽孢桿菌孢子(SporesofBacilluspumilus，如NCTC10327、NCIMB10692、ATCC27142)。置于放射劑量25kGy條件下，D值約3kGy。

26/43過(guò)濾除菌法

系利用細(xì)菌不能經(jīng)過(guò)致密具孔濾材原理以除去氣體或液體中微生物方法。

適用范圍：對(duì)熱不穩(wěn)定藥品溶液、氣體、水或原料除菌。

27/43慣用生物指示劑濾膜孔徑為0.22μm濾器：缺點(diǎn)假單胞菌(Pseudomonasdiminuta,如ATCC19146)濾膜孔徑為0.45μm濾器：黏質(zhì)沙雷菌(Serratin

marcescens,如ATCC14756)28/43制藥工業(yè)慣用滅菌方法原料藥：化學(xué)合成藥——較高熔點(diǎn)藥品慣用于干熱滅菌法，對(duì)較低熔點(diǎn)則用濕熱滅菌法，對(duì)不耐熱藥品，如是晶體，可溶解后過(guò)濾除菌；

植物提取物——若是用常規(guī)或高溫提取單一成份流浸膏，慣用壓力蒸汽法、流通蒸汽法消毒滅菌；若是低溫提取物，則優(yōu)先考慮過(guò)濾除菌；

生化藥品——化學(xué)消毒滅菌劑，如低溫乙醇法、低溫間歇法和過(guò)濾法等。29/43藥品制劑：輸液劑和水針劑——壓力蒸汽滅菌法；熱不穩(wěn)定藥品如凍干粉針劑——過(guò)濾法；多數(shù)藥液——射線滅菌。軟膏等半固體制劑：干熱法或輻射法中藥：大部份藥材——壓力蒸汽法；除含揮發(fā)油、對(duì)熱不穩(wěn)定成份藥材和生、熟功效不同藥材——熱力法和輻射法。

30/43抗生素生產(chǎn)：培養(yǎng)基、種子罐和發(fā)酵罐——壓力蒸汽法；無(wú)菌空氣——過(guò)濾法；最終產(chǎn)品——過(guò)濾法。水和空氣：過(guò)濾法、甲醛蒸氣法。包裝材料：玻璃材質(zhì)安瓿、西林瓶——干熱法；聚乙烯、聚丙烯等塑料包裝材料等——100℃蒸汽；橡膠塞等——濕熱法。

31/43廠房設(shè)施、設(shè)備和工器具：

不銹鋼制密閉設(shè)備、管道——壓力蒸汽；小設(shè)備零部件、工器具和容器——干熱法或濕熱法；耐酸堿而不耐高溫塑料材質(zhì)物品——過(guò)氧化氫法；潔凈工作服、清潔工具——壓力蒸汽法。32/43慣用滅菌方法匯總滅菌方法適用范圍濕熱法(壓力蒸汽、流通蒸汽)設(shè)備、釜罐、管道、器械、耐熱液體制劑、生藥、無(wú)菌衣、清潔工器具等干熱法(>170℃)一些設(shè)備、器械、耐熱干粉粉劑、安瓿和西林瓶等包裝容器射線法耐輻射藥劑、生藥、包裝容器等環(huán)氧乙烷包裝材料、器械、生藥等過(guò)氧化物類(過(guò)氧化氫、二氧化氯)一些設(shè)備表面、工作臺(tái)、器械、空氣、水等醛類(甲醛、戊二醛)器械、工作臺(tái)、包裝臺(tái)、空氣過(guò)濾除菌法空氣、水、不耐熱液體藥劑、生化藥劑33/43滅菌方法孢子生物指示劑產(chǎn)品蒸汽嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子、生孢梭菌孢子Smart-Read?EZTest?System（SEZS/5,SEZS/6）EZTest?(EZS/5,EZS/6)EZTestTestPack(STP)Releasat?(RS5/100,RS6/100)SGMStrip?(SGMS,SGMD)環(huán)氧乙烷枯草芽孢桿菌孢子EZTest?(EZG/6)EZTestTestPack(ETP)Releasat?(RG/100)SGMStrip?(SGMG,SGMD)低溫甲醛蒸汽嗜熱脂肪芽胞桿菌孢子SGMStrip?(SGMLF/6)34/43滅菌方法孢子生物指示劑液體蒸汽嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子、枯草芽孢桿菌孢子SterilAmpII?(SA/4,SA/5,SA/6)SterilAmpII“5230”(SASU/6)MagnaAmp?(MA/5,MA/6)輻射短小芽孢桿菌孢子SGMStrip?(SGMR)干熱枯草芽孢桿菌孢子DriAmp?CulturingSet(DH/50)環(huán)氧丙烷嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子EZTest?(EZP/5)過(guò)氧化氫嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子ApexEZTest?(EZH/6)二氧化氯枯草芽孢桿菌孢子SGMStrip?(SGMG,SGMD)35/43生物指示劑使用

選擇適當(dāng)生物指示劑正確使用生物指示劑放置位置、數(shù)目、放置方式使用之后處理36/43選擇適當(dāng)生物指示劑37/43生物指示劑放置位置應(yīng)放在滅菌最困難地方：①在滅菌器中最大包裝中心；②滅菌器排氣口，往往不易到達(dá)滅菌溫度；③靠滅菌器門口和底部；④不一樣生物指示劑擺放要求不一樣。38/43依據(jù)設(shè)備規(guī)格調(diào)整指示劑數(shù)量，提議不少于2支，普通每個(gè)滅菌周期使用不少于10支。冷藏保留生物指示劑使用前須