《非線性光學(xué)顯微成像技術(shù)分析》3300字

非線性光學(xué)顯微成像技術(shù)分析綜述在20世紀(jì)90年代，當(dāng)鎖模紅外激光器被發(fā)明時(shí)，非線性光學(xué)成像模式滿足了對(duì)高峰值功率激光器的需求。在高峰值功率脈沖激光作用下，光與物質(zhì)的相互作用驅(qū)動(dòng)了各種非線性光學(xué)過(guò)程。非線性過(guò)程依賴于入射的超快脈沖激光通過(guò)高數(shù)值孔徑物鏡產(chǎn)生的高強(qiáng)度聚焦。與共焦顯微鏡相比，非線性光學(xué)顯微鏡的主要優(yōu)點(diǎn)是成像能力強(qiáng)，組織樣品的空間分辨率高。非線性過(guò)程依賴于通過(guò)高數(shù)光圈客觀透鏡對(duì)傳入的超快脈沖激光器的緊密聚焦產(chǎn)生的高強(qiáng)度。由于對(duì)高強(qiáng)度的要求，非線性信號(hào)中的有效激發(fā)體積遠(yuǎn)小于線性信號(hào)，并提供具有亞細(xì)胞細(xì)節(jié)和高分子對(duì)比度的三維成像能力[20]。因此，探究非線性光學(xué)顯微成像技術(shù)是必不可少的環(huán)節(jié)。（一）雙光子熒光（two-photonfluorescence,TPF）顯微成像熒光顯微成像是在現(xiàn)代生命科學(xué)研究領(lǐng)域使用廣泛且功能強(qiáng)大的成像技術(shù)。熒光團(tuán)通過(guò)特異性標(biāo)記結(jié)合在靶標(biāo)上，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)熒光信號(hào)來(lái)確定細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)分布情況，利用共聚焦技術(shù)來(lái)增加其空間分辨率。該技術(shù)所發(fā)出的熒光信號(hào)能夠提供極佳的成像對(duì)比度，甚至可以獲得分子水平信號(hào)。1990年，在鎖模激光發(fā)明后，Denk等人[21]首次開發(fā)了雙光子熒光掃描顯微鏡，用于活體細(xì)胞成像。非線性激發(fā)需要極高的光子通量，因此采用飛秒脈沖激光與高數(shù)值孔徑物鏡相結(jié)合，在焦點(diǎn)處產(chǎn)生高光通量。在TPF中，選擇熒光團(tuán)的激發(fā)波長(zhǎng)，使其同時(shí)吸收兩個(gè)光子。激發(fā)光子的總能量應(yīng)等于或超過(guò)熒光團(tuán)基態(tài)和激發(fā)態(tài)之間的能隙，才能發(fā)生TPF。熒光標(biāo)記或探針的優(yōu)點(diǎn)，可用于選擇性標(biāo)記活體系統(tǒng)內(nèi)的分子，以便可視化，極大地促進(jìn)了對(duì)生物系統(tǒng)中細(xì)胞和分子方面的理解[20]。在過(guò)去的幾十年里，TPF顯微鏡在癌癥研究中得到了廣泛的關(guān)注，包括腫瘤的啟動(dòng)、增殖、代謝和血管生成及其微環(huán)境[22]。隨著新藥和新診斷方法的進(jìn)步，TPF成像技術(shù)有助于治愈癌癥和提高生活質(zhì)量。（二）二次諧波（second-harmonicgeneration,SHG）顯微成像隨著技術(shù)發(fā)展和改進(jìn)，科學(xué)家們研究出多光子熒光顯微探測(cè)技術(shù)，增加熒光的激發(fā)波長(zhǎng)范圍，從而可以穿透更厚的樣品。盡管取得了極大的成功，但對(duì)于熒光標(biāo)記或分子的需求仍然限制了熒光顯微鏡的應(yīng)用。這些方法不適合一些不發(fā)射熒光或者信號(hào)較弱的、尺寸小的分子，通常需要熒光染色進(jìn)行特異性標(biāo)記（例如熒光探針、熒光蛋白和熒光染料法）來(lái)觀察細(xì)胞內(nèi)生命行為，而且許多生物分子容易被熒光標(biāo)記干擾。另一方面，有些物質(zhì)無(wú)法進(jìn)行熒光標(biāo)記，而且常對(duì)于死細(xì)胞繼續(xù)操作，因?yàn)閷?duì)活細(xì)胞標(biāo)記會(huì)影響生命活動(dòng)，還會(huì)帶來(lái)光漂白和光損傷的問(wèn)題。因此，熒光團(tuán)在活體中的表達(dá)水平和特異性可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，科學(xué)家們繼續(xù)探索一些使用熒光以外的具有對(duì)比度的光學(xué)成像方法。SHG顯微成像技術(shù)是一種利用光與物質(zhì)相互作用產(chǎn)生的二次諧波信號(hào)，從而進(jìn)行顯微成像或探測(cè)的現(xiàn)代非線性光學(xué)顯微技術(shù)。它是一種無(wú)標(biāo)簽的非線性光學(xué)過(guò)程，因此，SHG顯微鏡無(wú)需熒光團(tuán)即可完成無(wú)標(biāo)記的成像，并能夠獲得生物組織、活體的分子和結(jié)構(gòu)信息，甚至可以用于醫(yī)學(xué)成像診斷等領(lǐng)域。例如，如圖4-1所示，科學(xué)家們通過(guò)SHG成像技術(shù)檢測(cè)乳頭層和網(wǎng)狀層膠原纖維，從而探究燒燙傷瘢痕膠原纖維的病理變化[23]。SHG顯微鏡具有獨(dú)特的性質(zhì)，比如有天然的光學(xué)切片能力，它可以在高散射的組織中獲得深度成像，通常采用近紅外飛秒激光作為激發(fā)源，從而減少了光漂白，減少了光對(duì)生物樣品的損傷，同時(shí)增加了樣品的穿透深度。圖4-1乳頭層和網(wǎng)狀層膠原纖維的SHG成像技術(shù)的成像圖[23]SHG的信號(hào)來(lái)自于材料自身的結(jié)構(gòu)和光學(xué)特性，通常用于非中心對(duì)稱分子和有序結(jié)構(gòu)成像，比如膠原纖維、微管、肌球蛋白、淀粉、皮膚組織和角膜基質(zhì)。SHG顯微鏡依賴于使用聚焦緊密的短激光脈沖所提供的固有光學(xué)切片能力，這將成像產(chǎn)生的信號(hào)光限制在入射光脈沖焦點(diǎn)處的小體積，大大降低了非焦點(diǎn)區(qū)域發(fā)射對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響。因此，與傳統(tǒng)的激光共焦顯微鏡相比，SHG顯微鏡可以實(shí)現(xiàn)在無(wú)共焦針孔、高信噪比和較高三維空間分辨率下進(jìn)行高分辨率成像，并可以對(duì)一定厚度的樣品進(jìn)行層析成像。SHG顯微鏡圖像取決于基本光束強(qiáng)度和相位的空間變化，以及有害粒子的空間分布和相位匹配[24]。SHG顯微成像需要掃描聚焦的基本光束，然后進(jìn)行單點(diǎn)檢測(cè)，通過(guò)樣品旋轉(zhuǎn)，然后進(jìn)行多視圖配準(zhǔn)和重建，可以獲得三維圖像[25]。當(dāng)二次諧波信號(hào)用于成像或檢測(cè)時(shí)，其相干性使其對(duì)樣品的局部微觀結(jié)構(gòu)非常敏感。因此，檢測(cè)到的二次諧波信號(hào)不僅可以反映樣品強(qiáng)度的信息，還可以反映樣品的分子的方向和排列等局部微觀結(jié)構(gòu)。這些重要的背景信息可以通過(guò)分析信號(hào)的角度分布或偏振特性來(lái)獲得。SHG顯微鏡可以同時(shí)采集回波信號(hào)并進(jìn)行檢測(cè)，與TPF顯微成像技術(shù)等多種技術(shù)實(shí)現(xiàn)多通道顯微成像和檢測(cè)，更有利于圖像結(jié)果的對(duì)比研究和信號(hào)的互補(bǔ)性。（三）相干反斯托克斯拉曼散射（coherentanti-StokesRamanscattering,CARS）顯微成像近些年來(lái)，科學(xué)家們還發(fā)現(xiàn)了一種通過(guò)探測(cè)目標(biāo)分子的特征振動(dòng)來(lái)提獲取信號(hào),同時(shí)可以在無(wú)需標(biāo)記的條件下，基于非線性光學(xué)過(guò)程產(chǎn)生非線性信號(hào)的新型顯微技術(shù)——相干反斯托克斯拉曼散射（coherentanti-StokesRamanscattering,CARS）。CARS是一種具有高靈敏度、高空間分辨率和三維成像能力的三階非線性效應(yīng)。CARS具有抗干擾性和良好的方向性，該方法大大增強(qiáng)拉曼散射的信號(hào)，是傳統(tǒng)拉曼散射信號(hào)的106-109倍，可以廣泛應(yīng)用于活細(xì)胞的光譜檢測(cè)和顯微成像中，并能完整觀測(cè)樣本和活細(xì)胞，為生物細(xì)胞學(xué)提供了便利的檢測(cè)工具[26]。早期單頻的CARS是通過(guò)兩個(gè)脈沖激光器產(chǎn)生泵浦光和斯托克斯光，兩者產(chǎn)生的光頻差滿足物質(zhì)中化學(xué)鍵時(shí)，樣品被激發(fā)產(chǎn)生CARS信號(hào)。不過(guò)單頻的CARS只能探測(cè)一種共振鍵，無(wú)法準(zhǔn)確各類分子。因此，科學(xué)家們改進(jìn)了傳統(tǒng)方法，利用一個(gè)激光器和一個(gè)脈沖泵浦光學(xué)參量振蕩器（opticalparameteroscillator，OPO），未散盡的激光提供CARS的泵浦光，OPO的信號(hào)作為CARS的斯托克斯光，經(jīng)過(guò)操作使兩個(gè)脈沖重合，從而產(chǎn)生CARS信號(hào)[26]。為了產(chǎn)生譜寬較大、平坦且連續(xù)性好、功率密度高的超連續(xù)譜（supercontinuum，SC）,研究人員們采用超短脈沖激光泵浦光子晶體光纖（photoniccrystalfiber，PCF），可同時(shí)探測(cè)比較寬光譜范圍。該方法僅需要一臺(tái)激光器就可以進(jìn)行光譜探測(cè)，如圖4-2所示。圖4-2超短脈沖激光器利用PCF構(gòu)建CARS系統(tǒng)[26]（四）受激拉曼散射(stimulatedRamanscattering，SRS)顯微成像近些年來(lái)，無(wú)標(biāo)記光學(xué)顯微成像技術(shù)在日益發(fā)展與進(jìn)步，是很多研究領(lǐng)域的重要組成部分。其中，受激拉曼散射(stimulatedRamanscattering，SRS)顯微成像技術(shù)逐漸成熟。自發(fā)拉曼光譜成像技術(shù)相比SRS成像速度更快，分辨率和靈敏度更高[11]。雖然CARS顯微鏡有較高的靈敏度，但它受到背景非共振信號(hào)的嚴(yán)重干擾，導(dǎo)致光譜的復(fù)雜性和圖像分析的困難，從而限制了靈敏度。SRS顯微鏡可以克服非共振背景信號(hào)的干擾，它作為一種新型無(wú)標(biāo)記顯微技術(shù)，逐漸得到重視。SRS成像具有基于拉曼光譜的分子靶向能力[11]。通過(guò)調(diào)節(jié)波長(zhǎng)，不同分子可以同時(shí)進(jìn)行特異性成像，分析他們的時(shí)空分布，了解特定的關(guān)系?？茖W(xué)家們發(fā)現(xiàn)，可見光在SRS成像系統(tǒng)下的拉曼散射截面和成像的靈敏度相比于其它系統(tǒng)提升了幾十倍[11]。該方法不僅可以提供更加豐富的信息，規(guī)避了熒光成像所帶來(lái)得不足，還使得光譜的分辨率更高。對(duì)于SRS顯微鏡，信號(hào)是由一個(gè)皮秒激光作用于一個(gè)拉曼模式產(chǎn)生的[11]。高光譜SRS可以通過(guò)掃描拉曼位移獲得光譜成像。拉曼光譜的掃描可以通過(guò)改變激光輸出波長(zhǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)，不同波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)于不同的拉曼位移，因此該方法可以獲得較寬的成像范圍。SRS顯微鏡可用于復(fù)雜分子混合物的成像，通過(guò)分辨重疊的拉曼光譜、在空間上進(jìn)行傅里葉展開、用多元曲線分析方法重建SRS圖像等一系列操作和處理，可對(duì)樣品進(jìn)行定量分析[11]。SRS成像也可以通過(guò)在光路上引入分散介質(zhì)進(jìn)行光譜聚焦來(lái)實(shí)現(xiàn)，利用脈沖將整個(gè)帶寬集中至一個(gè)窄帶的光譜區(qū)域，可將光譜壓縮百倍。但由于泵浦光和斯托克斯光的匹配問(wèn)題，光譜聚焦法得到的光譜分辨率低于前一種方法[11]。高分辨率的高光譜SRS在生物領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用，例如對(duì)多種生物細(xì)胞的生存狀態(tài)的研究。如圖4-3所示，通過(guò)SRS成像，可以清晰觀察到細(xì)胞的核膜和核仁的圖像[11,12]。圖4-3Hela細(xì)胞的可見光SRS成像得到的圖像