高效液相實驗報告

化學(xué)與環(huán)境化學(xué)科學(xué)學(xué)院分析化學(xué)駱洪偉20144015016高效液相實驗報告實驗?zāi)康牧私飧咝б合嗟膶嶒炘?。學(xué)習(xí)并掌握高效液相色譜儀(HPLC)的操作步驟。實驗原理高效液相色譜由儲液器，泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成，儲液器中的流動相被高壓泵打入系統(tǒng)，樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動相，被流動相載入色譜柱內(nèi)，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在兩相中作相對運動，經(jīng)過反復(fù)多次的吸附—解吸的分配過程，各組分在移動速度上產(chǎn)生較大的差別，被分離成單個組分依次從柱內(nèi)流出，通過檢測器時，樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀。HPLC的介紹及操作步驟高效液相色譜儀主要包括高壓輸送系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)及梯度洗脫等輔助裝置。其工作流程如圖1所示。高壓輸液系統(tǒng)高壓進(jìn)樣系統(tǒng)的作用是提供足夠恒定的高壓，使流動相以穩(wěn)定的流量快速滲透通過固定相。高壓輸液系統(tǒng)由貯液器、高壓泵、過濾器和梯度洗脫裝置組成，其核心部件是高壓泵，要求高壓泵具有輸出壓力(1.5×107～4.5×107Pa)，輸出流量恒定(精度0.1mL·min-1)，流量設(shè)定范圍可調(diào)。梯度洗脫裝置的作用是在分離過程中，按一定程序連續(xù)改變流動相中多種不同性質(zhì)溶劑的配比，以改變流動相的極性、離子強(qiáng)度或酸度等，從而提高試樣的分離效率，縮短分析時間，使色譜峰形得到改善，提高測定的靈敏度和定量的準(zhǔn)確度。此外，還附有加熱脫氣、超聲波脫氣等裝置，以排除溶解在流動相或試樣中的氣體。進(jìn)樣系統(tǒng)在高效液相色譜中，一般采用旋轉(zhuǎn)式六通閥于高壓下進(jìn)樣。采用旋轉(zhuǎn)式六通閥進(jìn)樣的優(yōu)點是進(jìn)樣量可變范圍大，耐高壓，宜于進(jìn)樣自動化，但易造成色譜峰柱前擴(kuò)展。分離系統(tǒng)液相色譜柱一般采用內(nèi)壁拋光的優(yōu)質(zhì)不銹鋼管或厚壁玻璃管。為使工作壓力不致過高，柱長都比較短，一般在5～30cm，柱徑為4～5mm。柱子的填充取決于柱填料的性能，對于生物膠或離子交換樹脂等，因遇到溶劑會膨脹，所以必須采用勻漿濕法填充。為防止顆粒大的填料先沉降而產(chǎn)生分層現(xiàn)象，可采用等密度溶劑(四氯乙烷和四氯乙烯混合物)配成勻漿。用高壓泵將其快速壓入裝有流動相的色譜柱中，經(jīng)沖洗后，即可使用。檢測記錄系統(tǒng)高效液相色譜檢測器要求具有靈敏度高、噪聲低、線性范圍寬、響應(yīng)快、死體積小等特點，且對溫度和流量的變化不敏感。目前，液相色譜常用檢測器有紫外光度檢測器、示差折光檢測器、熒光檢測器和電化學(xué)檢測器等。HPLC操作步驟過濾流動相，根據(jù)需要選擇不同的濾膜。對抽濾后的流動相進(jìn)行超聲脫氣10-20分鐘。打開HPLC工作站（包括計算機(jī)軟件和色譜儀），連接好流動相管道，連接檢測系統(tǒng)。進(jìn)入HPLC控制界面主菜單，點擊manual，進(jìn)入手動菜單。有一段時間沒用，或者換了新的流動相，需要先沖洗泵和進(jìn)樣閥。沖洗泵，直接在泵的出水口，用針頭抽取。沖洗進(jìn)樣閥，需要在manual菜單下，先點擊purge，再點擊start，沖洗時速度不要超過10mL·min-1。調(diào)節(jié)流量，初次使用新的流動相，可以先試一下壓力，流速越大，壓力越大，一般不要超過2000。點擊injure，選用合適的流速，點擊on，走基線，觀察基線的情況。設(shè)計走樣方法。點擊file，選取select?users?and?methods，可以選取現(xiàn)有的各種走樣方法。若需建立一個新的方法，點擊new?method。選取需要的配件，包括進(jìn)樣閥，泵，檢測器等，根據(jù)需要而不同。選完后，點擊protocol。一個完整的走樣方法需要包括：a.進(jìn)樣前的穩(wěn)流，一般2-5分鐘；b.基線歸零；c.進(jìn)樣閥的loading-inject轉(zhuǎn)換；d.走樣時間，隨不同的樣品而不同。進(jìn)樣和進(jìn)樣后操作。選定走樣方法，點擊start。進(jìn)樣，所有的樣品均需過濾。方法走完后，點擊postrun，可記錄數(shù)據(jù)和做標(biāo)記等。全部樣品走完后，再用上面的方法走一段基線，洗掉剩余物。關(guān)機(jī)時，先關(guān)計算機(jī)，再關(guān)液相色譜。登記。注意事項泵的使用和維護(hù)注意事項為了延長泵的使用壽命和維持其輸液的穩(wěn)定性，必須按照下列注意事項進(jìn)行操作：①防止任何固體微粒進(jìn)入泵體，因為塵埃或其它任何雜質(zhì)微粒都會磨損柱塞、密封環(huán)、缸體和單向閥，因此應(yīng)預(yù)先除去流動相中的任何固體微粒。流動相最好在玻璃容器內(nèi)蒸餾，而常用的方法是濾過，可采用Millipore濾膜（0.2μm或0.45μm）等濾器。泵的入口都應(yīng)連接砂濾棒（或片）。輸液泵的濾器應(yīng)經(jīng)常清洗或更換。②流動相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì)，含有緩沖液的流動相不應(yīng)保留在泵內(nèi)，尤其是在停泵過夜或更長時間的情況下。如果將含緩沖液的流動相留在泵內(nèi)，由于蒸發(fā)或泄漏，甚至只是由于溶液的靜置，就可能析出鹽的微細(xì)晶體，這些晶體將和上述固體微粒一樣損壞密封環(huán)和柱塞等。因此，必須泵入純水將泵充分清洗后，再換成適合于色譜柱保存和有利于泵維護(hù)的溶劑（對于反相鍵合硅膠固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。③泵工作時要留心防止溶劑瓶內(nèi)的流動相被用完，否則空泵運轉(zhuǎn)也會磨損柱塞、缸體或密封環(huán)，最終產(chǎn)生漏液。④輸液泵的工作壓力決不要超過規(guī)定的最高壓力，否則會使高壓密封環(huán)變形，產(chǎn)生漏液。⑤流動相應(yīng)該先脫氣，以免在泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性，如果有大量氣泡，泵就無法正常工作。如果輸液泵產(chǎn)生故障，須查明原因，采取相應(yīng)措施排除故障：①沒有流動相流出，又無壓力指示。原因可能是泵內(nèi)有大量氣體，這時可打開泄壓閥，使泵在較大流量（如5ml/min）下運轉(zhuǎn)，將氣泡排盡，也可用一個50ml針筒在泵出口處幫助抽出氣體。另一個可能原因是密封環(huán)磨損，需更換。②壓力和流量不穩(wěn)。原因可能是氣泡，需要排除；或者是單向閥內(nèi)有異物，可卸下單向閥，浸入丙酮內(nèi)超聲清洗。有時可能是砂濾棒內(nèi)有氣泡，或被鹽的微細(xì)晶?；蜃躺奈⑸锊糠侄氯?，這時，可卸下砂濾棒浸入流動相內(nèi)超聲除氣泡，或?qū)⑸盀V棒浸入稀酸（如4mol/L硝酸）內(nèi)迅速除去微生物，或?qū)Ⅺ}溶解，再立即清洗。③壓力過高的原因是管路被堵塞，需要清除和清洗。壓力降低的原因則可能是管路有泄漏。檢查堵塞或泄漏時應(yīng)逐段進(jìn)行。梯度洗脫在進(jìn)行梯度洗脫時，由于多種溶劑混合，而且組成不斷變化，因此帶來一些特殊問題，必須充分重視：①要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動相。有些溶劑在一定比例內(nèi)混溶，超出范圍后就不互溶，使用時更要引起注意。當(dāng)有機(jī)溶劑和緩沖液混合時，還可能析出鹽的晶體，尤其使用磷酸鹽時需特別小心。②梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證良好的重現(xiàn)性。進(jìn)行樣品分析前必須進(jìn)行空白梯度洗脫，以辨認(rèn)溶劑雜質(zhì)峰，因為弱溶劑中的雜質(zhì)富集在色譜柱頭后會被強(qiáng)溶劑洗脫下來。用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣，以防止混合時產(chǎn)生氣泡。③混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因而在梯度洗脫時常出現(xiàn)壓力的變化。例如甲醇和水粘度都較小，當(dāng)二者以相近比例混合時粘度增大很多，此時的柱壓大約是甲醇或水為流動相時的兩倍。因此要注意防止梯度洗脫過程中壓力超過輸液泵或色譜柱能承受的最大壓力。④每次梯度洗脫之后必須對色譜柱進(jìn)行再生處理，使其恢復(fù)到初始狀態(tài)。需讓10~30倍柱容積的初始流動相流經(jīng)色譜柱，使固定相與初始流動相達(dá)到完全平衡。溶劑過濾頭的清洗①取下過濾頭放在(1:4,V/V)的硝酸溶液燒杯中超聲清洗15分鐘；②取出后用蒸餾水超聲清洗10分鐘；③用吸球吹出過濾頭中的液體；④再用蒸餾水超聲清洗10分鐘；⑤用吸球吹凈過濾頭中的水份；⑥將過濾頭重新插入溶劑瓶中(正相系統(tǒng)注意將過濾頭烘干)。流動相的更換①將新流動相置于儲液瓶