TSDHCST 001-2024 產(chǎn)前熒光原位雜交實驗操作技術規(guī)范

ICS07.080CCSA40團 體 標 準T/SDHCST001—2024產(chǎn)前熒光原位雜交實驗操作技術規(guī)范TechnicalSpecificationforPrenatalFluorescenceinsituhybridization2024年6月12日布 2024年7月10實施T/SDHCST001—2024T/SDHCST001—2024ⅠⅠ目錄TOC\o"1-1"\h\z\u前 言 2范圍 1規(guī)范性引用文件 1術語和定義 1符號和縮略語 2檢測時間與用量 2熒光原位雜交產(chǎn)前診斷對象 2羊膜穿刺術前準備 3樣本采集與處理 3儀器與試劑準備 4操作步驟 5室內(nèi)質(zhì)量控制標準 9T/SDHCST001—2024T/SDHCST001—2024ⅡⅡ前 言本標準依照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化標準的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本標準由山東省保健科技協(xié)會提出并歸口。本標準為首次發(fā)布。T/SDHCST001—2024T/SDHCST001—2024PAGEPAGE1產(chǎn)前熒光原位雜交實驗操作技術規(guī)范范圍本標準規(guī)定了產(chǎn)前熒光原位雜交技術(FISH)的檢測時間、檢測疾病、檢測對象、檢測流程、檢測報告、資料和標本的管理和質(zhì)量控制。131821XY目異常孕婦進行染色體非整倍性的快速輔助診斷。規(guī)范性引用文件件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標準。GB19489實驗室生物安全通用要求；GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法；《熒光原位雜交技術在產(chǎn)前診斷中的專家共識》；《醫(yī)療廢物管理條例》。術語和定義下列術語和定義適用于本文本。羊膜穿刺術（Amniocentesis）16～24羊膜穿刺時，不易刺傷胎兒。熒光原位雜交（Fluorescenceinsituhybridization,FISH）具有安全快速、敏感高效、探針可長期保存、能同時顯示多種顏色等優(yōu)點。符號和縮略語FISH：熒光原位雜交；DAPI：4',6-二脒基-2-苯基吲哚；PBS：磷酸緩沖鹽溶液檢測時間與用量16-248-10mL。羊水16180200m2030mL左右的羊水也較為安全，是中孕期羊膜腔穿刺的最佳時機。熒光原位雜交產(chǎn)前診斷對象羊膜穿刺術指征預產(chǎn)期年齡≥35產(chǎn)前篩查（NIPT）高風險者；夫婦一方為染色體異?；蜻z傳性疾病攜帶者；曾生育過染色體異?；騿位虿〉幕純?；超聲發(fā)現(xiàn)胎兒結構異常；其他需要抽取羊水檢查的情況。羊膜穿刺術禁忌癥先兆流產(chǎn)；術前兩次測量體溫（腋溫）37.2℃；（3）有出血傾向（血小板≦70×109/L）；有盆腔或?qū)m腔感染征象；無醫(yī)療指征的胎兒性別鑒定等。羊膜穿刺術前準備術前告知簽署知情同意書認真核對適應癥及有無禁忌癥；情同意書。完善相關術前檢查（1）血分析、尿分析、凝血四項、傳染病八項、ABO血型、Rh血型等；（2）B超檢查了解情況以及胎盤附著情況。樣本采集與處理標本的采集門診標本由擁有產(chǎn)前診斷資格的醫(yī)師采集，抽出的羊水注入無菌離心管內(nèi)（本操作在酒精燈火焰附近進行B5mL2mL20mL，22-3min，2h。380無標本外泄發(fā)生。床科室或相關人員聯(lián)系核實。標本接收人須檢查標本狀態(tài)。本不合乎要求，須在記錄本上記錄拒收原因標本的保存處理前的標本保存新鮮羊水離心儲存置4℃過夜備用。報告發(fā)出后的標本保存：a）1.5mLb）載玻片可于-20℃1儀器與試劑準備儀器移液器（sartorius）、數(shù)顯恒溫三用水浴箱（江蘇金域國勝實驗儀器廠）、通風柜（山東-豪邁）、離心機（江蘇金域國勝實驗儀器廠）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（。試劑甲醇（國藥，AR）、冰醋酸（國藥，AR）、75%及無水乙醇（國藥）純水、生理鹽水、產(chǎn)前染色體數(shù)目檢測試劑盒（安必平）。產(chǎn)前染色體數(shù)目檢測試劑盒檢測位點如下：可檢測疾病目標染色體檢測區(qū)域T21（唐氏綜合征）21號染色體21q22.13T18（愛德華氏綜合征）18號染色體18p11.1-q11.1T13（帕陶氏綜合征）13號染色體13q14.2性染色體數(shù)目異常疾病X染色體Xp11.1-q11.1Y染色體Yp11.1-q11.1操作步驟制片低滲（1800r106mL37℃KCl輕輕吹打細胞，37℃32min，8min14固定固定液需新鮮配制，固定液比例為甲醇：乙酸=3:1。2mL1min6mL10min（2）。滴片F(xiàn)ISH1.5mLFISH20μL1.5mL老化玻片將滴片后的載玻片至于56℃烤箱中烤片0.5～1h。預處理純水+400μL1MHCL37℃100μL10%的胃蛋白酶。371*PBS5min。3710min。1*PBS3min。1%多聚甲醛/PBS10min。1*PBS3min。70%90%100%2min。取出玻片，室溫晾干。變性封片2-8℃冰箱中取出雜交液，3710min后，震蕩均勻。10μL13/21雜交液、18/XY區(qū)域，立刻加蓋蓋玻片，然后用橡皮膠封片。825min。雜交37（452-4h）。雜交后洗滌I72℃水浴鍋中提前預熱。將雜交后的載玻片取出，輕輕撕去橡皮膠，移去蓋玻片（II72℃I中）。72℃I5min。II2min。70%、90%、100%2min。取出載玻片，室溫晾干。復染10μLPI10min后即可觀察。鏡檢相關熒光需用合適的濾塊觀察；其中，13/21雜交液區(qū)染色體探針分別顯示/綠色（G）/紅色（R）信號針分別顯示為綠色。10X100X信號并計數(shù)；對信號和背景有明確的概念；信號點應位于細胞核內(nèi)；當細胞核外存在熒從左上到右下的折線方式連續(xù)觀察；只計數(shù)每種顏色熒光信號點≥1注意跳過信號弱及沒有特定信號或高背景的核計數(shù)；結果判讀:雙人獨立閱片，高級職稱檢驗者審核，每個標本隨機計數(shù)50個細胞核：（1）13/21號染色體判讀：綠色（G）/紅色（R）顯示2個熒光信號時為正常；若綠色（G）/紅色（R）顯示3個熒光信號時則為13/21號三體型。（2）18/X/Y染色體判讀：18號染色體判讀：青色（A）顯示2個熒光信號時為正常，顯示3個熒光信18性染色體判讀：女性：綠色（G）2個熒光信號時為正常（46,XX）；若綠色（G）3X染色體三體型（47,XXX）；若綠色（G）1X染色體單體型（45,X）。男性：綠色（G）/紅色（R）1（46,XY）；若綠色（G）顯示2個熒光信號,紅色（R）顯示1個熒光信號時為克氏綜合征1個熒光信號,2超雄綜合征（47,XYY）.單獨判斷每種指正：正常細胞比例≥90%，異常細胞的比例≤10%，提示該指標未見異常。當出現(xiàn)嵌合體（10%-60%）100個細胞核，當樣本中可被有效分析的細胞核少于50個時，應增加一張樣本片繼續(xù)計數(shù)分析，或判斷為樣本信息不足。實驗記錄FISH實驗質(zhì)控記錄單》；1FISH樣本計數(shù)單》，做好樣本數(shù)據(jù)記錄。室內(nèi)質(zhì)量控制標準注意離心力的大小，過大會導致細胞核破裂，導致標本作廢。洗脫步驟很關鍵，增加洗脫時間，升高溫度或降低鹽溶液濃度可導致信號持標本的濕潤，以防載波片干燥后引起非特異性染色。PIDAPI是一種潛在致癌物，使用時注意避免直接皮膚接觸。蓋玻片下氣泡影響探針雜交，一旦發(fā)現(xiàn)，應想辦法