TSHQAP 018-2024 人真皮成纖維細胞

ICS07.080CCSC27團 體 標 準T/SHQAP018—2024人真皮成纖維細胞Humandermalfibroblast2024-12-27發(fā)布 2025-01-27實施上海市醫(yī)藥質量協(xié)會??發(fā)布T/SHQAP018T/SHQAP018—2024PAGE\*ROMANPAGE\*ROMANII目 次前 言 II范圍 1規(guī)范性引用文件 1術語和定義 1縮略語 1原材料和輔料 2制備的一般要求 2技術要求 2檢驗方法 3檢驗規(guī)則 3標簽 4包裝、儲存及運輸 4廢棄物處理 4附 錄 A （資料性）細胞存活率檢測 細胞計數(shù)法 5附 錄 B （規(guī)范性）細胞標志蛋白檢測 流式細胞法 6附 錄 C （規(guī)范性）細胞功能指標檢測 ELISA法 8附 錄 D （規(guī)范性）人成纖維細胞成瘤性檢測 裸鼠皮下接種法 9前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則 第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由上海市醫(yī)藥質量協(xié)會提出。本文件由上海市醫(yī)藥質量協(xié)會歸口。（上海（上海有限公（上海（上海T/SHQAP018T/SHQAP018—2024PAGEPAGE10人真皮成纖維細胞范圍本文件適用于人真皮成纖維細胞的制備和檢測。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單適用于本文件。中華人民共和國藥典（2020年版）GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T2985顯微鏡GB19815離心機安全要求GB/T26497電子天平YY/T0588流式細胞儀JJF1665細胞技術儀校準規(guī)范術語和定義下列術語和定義適用于本文件。人真皮成纖維細胞人體皮膚組織的真皮層分離的細胞注：人真皮成纖維細胞是疏松結締組織的主要細胞成分，可通過產生和重塑細胞外基質（ECM）參與組織修復與再生、創(chuàng)傷愈合。主細胞庫由細胞種子經培養(yǎng)至特定倍增水平或傳代水平，并經一次制備獲得并分裝的同質和均一的懸液。注：細胞種子是指已通過鑒定證明適用于生物制品生產或檢測的，來源于人或動物的，由一個原始細胞群體發(fā)展成傳代穩(wěn)定的細胞群體，或經過克隆培養(yǎng)以及基因工程構建的均一細胞群體。工作細胞庫由主細胞庫的細胞經培養(yǎng)至特定倍增水平或傳代水平，并經一次制備獲得并分裝的同質和均一的懸液?？s略語下列縮略語適用于本文件。AO/PI:吖啶橙（AcridineOrange）和碘化丙錠（PropidiumIodide）CD：分化簇（ClusterofDifferentiation）COLIA1：I型膠原蛋白A1（CollagenTypeIA1）EBV：皰疹病毒（Epstein-BarrVirus）ELISA：酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay）HBV：乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus）HCMV：人類巨細胞病毒（HumanCytomegalovirus）HIV：人類免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus）HLA-DR,DP,DQ：人白細胞抗原DR,DP,DQ（HumanLeukocyteAntigen-DR,DP,DQ）HTLV：人類T淋巴細胞病毒（HumanT-lymphotropicvirus）PBMCs：外周血單個核細胞（PeripheralBloodMononuclearCells）TGFβ1：轉化生長因子β1（TransformingGrowthFactorBeta1）TP：梅毒螺旋體（Treponemapallidum）HCV：丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus）Vimentin：中間絲蛋白Ⅲ型（IntermediateFilamentProteinTypeⅢ）原材料和輔料HIVHBVHCVHTLVEBVHCMVTP，檢測結果應均為陰性,應排除有遺傳性疾病的供者，并應對供者進行一般情況篩查。應建立和執(zhí)行細胞采集、運輸、交接與儲存方法。細胞培養(yǎng)過程中使用的培養(yǎng)基及其他添加物等應建立質量標準，并按照質量標準進行控制。不宜使用動物血清或其他動物源成分，如必須使用，應確認無特定動物源性病毒感染。細胞凍存時使用的輔料，應建立質量標準，并按照質量標準進行控制。制備的一般要求人真皮成纖維細胞培養(yǎng)所需的基礎設施和環(huán)境條件，應符合生物安全的要求，滿足產品質量控制需要的潔凈條件并避免微生物污染和交叉污染。制備方應對制備操作人員進行培訓，建立考核標準，人員培訓考核合格后進行制備操作。制備方宜建立人真皮成纖維細胞的主細胞庫和工作細胞庫。人真皮成纖維細胞應長期凍存于低于-130人真皮成纖維細胞的制備應有標準操作規(guī)程，制備過程應符合標準操作規(guī)程的要求。人真皮成纖維細胞培養(yǎng)或使用時，應記錄細胞名稱，培養(yǎng)代次，細胞密度與細胞活率等信息。20技術要求人成纖維細胞應符合表1中技術要求。表1 人成纖維細胞技術要求類別項目技術要求鑒別細胞形態(tài)細胞應呈梭形和/或星形，貼壁生長細胞標志蛋白aCD105、CD90、Vimentin、COLIA1陽性比例均應≥80%CD45、HLA-DR,DP,DQ陽性比例均應小于5%活率細胞存活率未凍存時，人真皮成纖維細胞存活率宜≥80%凍存復蘇時，人真皮成纖維細胞存活率宜≥70%細胞功能細胞因子分泌水平（COLIA1）≥0ng/mL細胞因子分泌水平（TGFβ1）≥0ng/mL安全性無菌檢查無菌生長細菌內毒素＜3EU/mL異常毒性檢查動物全部健存且無異常反應，體重有增加支原體陰性成瘤性免疫缺陷動物體內成瘤實驗結果應為陰性染色體核型染色體核型應為46，XY或者46，XX結構異?！?0，超二倍體≤5，亞二倍體≤90，多倍體≤17類別項目技術要求a可表達不同的標志物。檢驗方法細胞形態(tài)體外培養(yǎng)，二維貼壁培養(yǎng)條件下，用顯微鏡進行細胞形態(tài)觀察。細胞標志蛋白按照附錄B細胞標志蛋白檢測進行試驗。細胞存活率按照附錄A細胞因子分泌水平（COLIA1）按照附錄C細胞功能指標檢測進行試驗。細胞因子分泌水平（TGFβ1）按照附錄C細胞功能指標檢測進行試驗。無菌檢查按照中華人民共和國藥典(2020年版)四部通則1101無菌檢查法進行試驗。細菌內毒素按照中華人民共和國藥典(2020年版)四部通則1143細菌內毒素檢查法進行試驗異常毒性檢查按照中華人民共和國藥典(2020年版)四部通則1141異常毒性檢查法進行試驗。支原體按照中華人民共和國藥典(2020年版)四部通則3301支原體檢查法進行試驗。成瘤性按照附錄D:人成纖維細胞成瘤性檢測進行試驗。染色體核型（2020年版檢驗規(guī)則抽樣方法在一個制備周期中，同一供體來源、同一制備線、同一代次、同一天收獲、同一方法制備出來的產品為一批。在同一批中，每個檢測項目（鑒別、活率、細胞功能、安全性）1檢驗每批次產品應進行出廠檢驗，并附檢驗報告。7判定規(guī)則使用符合第5章要求的原材料和輔料、制備過程符合第6章要求，且出廠檢驗項目全部符合第7章的技術要求時，判為合格品；有1項及以上不符合要求時，判為不合格品。標簽包裝、儲存及運輸包裝應選擇對人真皮成纖維細胞關鍵質量屬性無影響的材料和容器。儲存應選擇不影響細胞質量性狀的細胞凍存液、細胞保護液及其他液體。應在低于-130℃的環(huán)境下長期儲存。運輸凍存的細胞應在低于-130℃條件下運輸，非凍存細胞應在2℃～8℃條件下運輸。細胞運輸介質，如細胞凍存液、細胞保護液及其他液體，應能保證細胞活性廢棄物處理儀器和設備熒光細胞分析儀

附 錄 A（規(guī)范性）細胞存活率檢測細胞計數(shù)法熒光細胞分析儀應按照JJF1665要求進行儀器校準。細胞計數(shù)板應使用細胞技術儀適配的細胞計數(shù)板。試劑除另有說明外，所有試劑均為分析純，檢測用水應為符合GB/T6682要求的一級水。磷酸鹽緩沖液：稱取9g氯化鈉、0.2g氯化鉀、0.24g磷酸二氫鉀或1.44g磷酸氫二鈉、1.8800mLpH值至1升。該緩沖液的pH值應為7.2～7.4。AO/PI染液：吖啶橙和碘化丙錠染料。檢測步驟細胞懸液制備收集待檢測細胞，用磷酸鹽緩沖液（A.22）配置細胞懸液，細胞懸液終濃度宜在×16個細胞/mL110個細胞/m之間。細胞染色按1：1的體積比將AO/PI染液（A.2.2）與細胞懸液（A.3.1）混合均勻。細胞計數(shù)使用熒光細胞分析儀時，取混合好染料的樣品（A.3.2），上樣至計數(shù)板進行檢測,每個樣品需2個復孔檢測。在儀器面板上輸入實驗名稱，樣品編號，選擇細胞直徑參數(shù)（12-24μm），輸入稀釋比例，讀取總細胞密度、活細胞密度和活率。計算與分析細胞胞活率“%”、活細胞濃度“個細胞/mL”以及總細胞濃度“個細胞/mL為儀器直接讀取。精密度在重復性條件下進行兩次獨立測定，兩次測定結果的絕對誤差應不超過其算術平均值的10%。儀器和設備流式細胞儀應符合YY/T0588要求。水平離心機應符合GB19815要求。電子天平

附 錄 B（規(guī)范性）細胞標志蛋白檢測 流式細胞法顯示分度值0.1mg，符合GB/T264977要求。試劑除另有說明外，所有試劑均為分析純，檢測用水均為符合GB/T6682要求的一級水。磷酸鹽緩沖液，按照A.2.2要求配制?？谷薈D90，CD105,COLIA1Vimentin，CD45,HLA-DR,DP,DQ抗體及同型對照抗體。穿膜液：可用氯化鈉注射液配制，體積比為0.5%曲拉通X-100緩沖液，或直接購買市售穿膜液。穿膜液應于2℃～8℃保存。10固定液：含有4%多聚甲醛的組織固定液，于2℃～8℃保存。洗滌液：磷酸鹽緩沖液，于2℃～8℃保存。樣品保存標記后的樣品應于2℃～8℃保存。檢測步驟樣品準備收集細胞，用水平離心機（B.1.2）300×g，離心4min，棄去上清液，用洗滌液清洗一遍樣品，再用水平離心機（B.1.2）300×g，離心4min，棄去上清液?？贵w孵育細胞表面標志物抗體孵育min～60min。孵育結束后，用洗滌液清洗樣品兩遍，用水平離心機（B.1.2）300×g，離心4min，棄去上清液。細胞胞內標志物抗體孵育樣品放入15mL1mL30min4min，棄去上清液。樣品離心管中加入1mL穿膜液，孵育30min后，用水平離心機（B.1.2）300×g，離心4min，棄去上清液。樣品離心管中加入1mL30min4min，棄去上清液。選擇細胞標志蛋白對應的抗體及同型對照抗體，按照說明書稀釋抗體，抗體與細胞懸液混勻后，于2℃～8℃孵育30min～60min。孵育結束后，用洗滌液清洗兩遍，用水平離心機（B.1.2）300×g，離心4min，棄去上清液。過濾上機用洗滌液重懸細胞，通過孔徑為40μm濾網(wǎng)轉移到流式管中，使用流式細胞儀（B.1.1）上機檢測。圈門設定1B.1。12，排除沒有被熒光抗體B.1C。圖B.1圈門示意圖同型對照抗體作為陰性對照。B.4.4.2儀器和設備

附 錄 C（規(guī)范性）細胞功能指標檢測 ELISA法多功能酶標儀，應可以進行試劑盒推薦的波長檢測試劑COLIA1檢測試劑盒和TGFβ1檢測試劑盒。樣品保存實驗組為培養(yǎng)成纖維細胞3天的培養(yǎng)上清液，保存于2℃～8℃。對照組為成纖維細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基，保存于2℃～8℃。檢測步驟樣品準備收集5mL培養(yǎng)成纖維細胞3天的培養(yǎng)上清液，放入離心管中，用水平離心機（B.1.2）300×g，離心4min，取上清液，保存于2℃～8℃。樣品檢測按試劑盒操作說明將標準品稀釋至推薦的標準曲線使用濃度，樣品稀釋至推薦比例。將稀釋后的標準品和樣品加入試劑盒中的檢測板內并孵育一抗。一抗孵育完成后清洗檢測板，去除殘留洗滌液。孵育帶標簽的二抗。孵育完成后清洗檢測板，去除殘留洗滌液。檢測板內加入顯色劑，充分反應。根據(jù)試劑盒操作說明中推薦檢測波長，使用多功能酶標儀(C.1)進行檢測。計算判斷標準COLA1COLA10ngmLCOLIA1。（TGβ1：當TGF10ng/LTGFβ1（與正文中參數(shù)對應）儀器和設備熒光細胞分析儀

附 錄 D（規(guī)范性）人成纖維細胞成瘤性檢測 裸鼠皮下接種法熒光細胞分析儀應按照JJF1665要求進行儀器校準。細胞計數(shù)板應使用細胞技術儀適配的細胞計數(shù)板。水平離心機應符合GB19815標準要求。試劑除另有說明外，所有試劑均為分析純，檢測用水均為符合GB/T6682要求的一級水。磷酸鹽緩沖液：按照A.2.2配制，并進行高壓蒸汽滅菌。消化酶。AO/PI染液：吖啶橙和碘化丙錠染料。檢測步驟細胞消化人真皮成纖維細胞貼壁培養(yǎng)，匯合度達到80%以上時，用消化酶消化，用水平離心機（D.1.3）300×g，離心4min，棄去上清液，用磷酸鹽緩沖液（D.2.2）重懸細胞。細胞計數(shù)按A.3.3進行，使用細胞計數(shù)板（D.1.2）及熒光細胞分析儀（D.1.1）計算細胞懸液活細胞濃度，根據(jù)計數(shù)濃度，調整細胞密度至5×107個細胞/mL。細胞移植實驗組：將1×107個人真皮成纖維細胞活細胞，注射到6至8周齡的免疫缺陷型小鼠皮下，空白對照組不做處理，陽性對照組：人腫瘤細胞系，按照腫瘤細胞系接種要求的數(shù)量注射，為