體外化學(xué)法皮膚變態(tài)反應(yīng) 動力學(xué)直接多肽反應(yīng)試驗方法起草說明

體外化學(xué)法皮膚變態(tài)反應(yīng)動力學(xué)直接多肽反應(yīng)試驗方法起草說明為加強化妝品的監(jiān)督管理，進一步提高化妝品使用安全性，中國食品藥品檢定研究院組織開展了《體外化學(xué)法皮膚變態(tài)反應(yīng)動力學(xué)直接多肽反應(yīng)試驗》方法的研究制定工作?，F(xiàn)就工作有關(guān)情況說明如下：起草原則本方法起草是為順應(yīng)國際發(fā)展趨勢，遵循實驗動物3R原則，減少實驗動物用量，提升動物福利水平。積極轉(zhuǎn)化新途徑技術(shù)方法，促進我國化妝品安全評價技術(shù)與國際接軌。本方法主要轉(zhuǎn)化自O(shè)ECDTestGuidelineNo.442CInchemicoSkinSensitisationAssaysaddressingtheAdverseOutcomePathwaykeyeventoncovalentbindingtoproteins（Adopted:20June2022Corrected:25June2024），是比較成熟的、被多數(shù)國家和組織認(rèn)可的方法，原則上予以接受。在保證方法科學(xué)性和準(zhǔn)確性的同時，考慮到目前國內(nèi)各化妝品檢驗檢測實驗室實際的試驗條件和化妝品原料的特點，按照我國《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》的體例要求，提高了可操作性和便捷性。起草過程1.2023年11月，《化妝品安全技術(shù)規(guī)范動力學(xué)直接多肽反應(yīng)試驗》制修訂項目簽訂任務(wù)書。2.2023年12月，組織全文翻譯OECDTestGuidelineNo.442CInchemicoSkinSensitisationAssaysaddressingtheAdverseOutcomePathwaykeyeventoncovalentbindingtoproteins中APPENDIXⅢInchemicoSkinSensitisation：kineticdirectpeptidereactivityassay（kDPRA）部分和操作規(guī)程DB-ALMprotocol217：Thekineticdirectpeptidereactivityassay（kDPRA）。3.2024年1月，在本實驗室建立動力學(xué)直接多肽反應(yīng)試驗方法，依據(jù)OECDTG442C和DB-ALM方案217，制訂動力學(xué)直接多肽反應(yīng)試驗實驗室驗證作業(yè)指導(dǎo)書。4.2024年2月，組織委托國內(nèi)四家實驗室對10個盲樣開展實驗室協(xié)作驗證。5.2024年6月，結(jié)合我國化妝品監(jiān)管政策要求、檢測實驗室的技術(shù)水平以及化妝品原料（產(chǎn)品）的特點，起草了《體外化學(xué)法皮膚變態(tài)反應(yīng)動力學(xué)直接多肽反應(yīng)試驗》內(nèi)容包括方法適用范圍、試驗?zāi)康?、定義、試驗原理、試劑和受試物制備、試驗步驟、數(shù)據(jù)處理、試驗成立條件、結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)、注意事項部分，并對草案進行多次修訂完善。期間征求了合作單位中國食品藥品檢定研究院對草案的意見。5.2024年9月，向化妝品標(biāo)委會提交《體外化學(xué)法皮膚變態(tài)反應(yīng)動力學(xué)直接多肽反應(yīng)試驗》草案及起草說明、驗證報告等相關(guān)資料。6.2024年9月19日，召開化妝品標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會安全評價分技術(shù)委員會第一次全體會議，根據(jù)與會專家對“動力學(xué)直接多肽反應(yīng)試驗方法（kDPRA）”項目的評審意見，進一步規(guī)范了文本，修改了“9結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)”中預(yù)測結(jié)論的表述。與我國已有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系目前尚未見該方法的國家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。與《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）（以下簡稱《規(guī)范》）中原方法的對比情況《規(guī)范》中用于檢測皮膚變態(tài)反應(yīng)的方法包括：皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗、皮膚變態(tài)反應(yīng)：局部淋巴結(jié)試驗（DA）、皮膚變態(tài)反應(yīng)：局部淋巴結(jié)試驗（BrdU-ELISA）、化妝品用化學(xué)原料體外皮膚變態(tài)反應(yīng)：直接多肽反應(yīng)試驗、體外皮膚變態(tài)反應(yīng)人細(xì)胞系活化試驗、體外皮膚變態(tài)反應(yīng)氨基酸衍生化反應(yīng)試驗、體外皮膚變態(tài)反應(yīng)U937細(xì)胞激活試驗方法。體外皮膚變態(tài)反應(yīng)ARE-Nrf2熒光素酶LuSens試驗方法也已經(jīng)公示征求意見稿。其中皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗、局部淋巴結(jié)試驗均使用動物（豚鼠、小鼠）進行試驗；直接多肽反應(yīng)試驗方法和氨基酸衍生化反應(yīng)試驗方法針對皮膚變態(tài)反應(yīng)中的第一個關(guān)鍵分子事件進行檢測；LuSens試驗方法是針對皮膚變態(tài)反應(yīng)中的第二個關(guān)鍵分子事件進行檢測。人細(xì)胞系活化試驗針對皮膚變態(tài)反應(yīng)中的第三個關(guān)鍵分子事件進行檢測。動力學(xué)直接多肽反應(yīng)試驗也是針對皮膚變態(tài)反應(yīng)中的第一個關(guān)鍵分子事件進行檢測，試驗原理與直接多肽反應(yīng)試驗方法和氨基酸衍生化反應(yīng)試驗一致，但可以提供化合物皮膚致敏性亞類分級。該方法可以應(yīng)用在皮膚致敏評價的整合策略中，用于化妝品原料的風(fēng)險評估，并進一步提高替代試驗方法的準(zhǔn)確性和特異性。本研究建立了皮膚變態(tài)反應(yīng)的替代試驗方法，以期與國際標(biāo)準(zhǔn)接軌，與《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中皮膚變態(tài)反應(yīng)檢測方法在技術(shù)上形成互補，建立我國動物實驗替代方法體系，增補、修訂和完善現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)與規(guī)范方法以及促進我國未來的化妝品安全評價體系提供技術(shù)支持。國際相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)情況本方法主要轉(zhuǎn)化自經(jīng)濟合作和發(fā)展組織（OrganizationforEconomicCo-operationandDevelopment,OECD）TestGuidelineNo.442CInchemicoSkinSensitisationAssaysaddressingtheAdverseOutcomePathwaykeyeventoncovalentbindingtoproteins中APPENDIXⅢInchemicoSkinSensitisation：kineticdirectpeptidereactivityassay（kDPRA）部分。本方法評價了受試物與合成含半胱氨酸多肽的反應(yīng)動力學(xué)。具體為：將不同濃度的供試品與半胱氨酸多肽在25℃下孵育不同時間后，通過添加熒光染料單溴化亞胺（mBrB）來終止反應(yīng)，mBrB與未結(jié)合的半胱氨酸多肽快速反應(yīng)以形成熒光復(fù)合物，然后通過熒光測量確定剩余的未耗盡肽濃度算出多肽消耗率。如果最高濃度（5mM受試物）的消耗超過13.89%的閾值（DPRA中用于陽性的截止值），并且該消耗與僅含多肽的對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)顯著性，則進行進一步計算，將未消耗的肽濃度的自然對數(shù)與每個時間點的供試受試物濃度作圖。如果觀察到線性關(guān)系（相關(guān)系數(shù)>0.9），則確定該曲線的斜率，并除以孵育時間，以計算速率常數(shù)[min-1mM-1]。將該速率常數(shù)轉(zhuǎn)換為[s-1M-1]單位，并取對數(shù)。將在任何時間點觀察到的最大值作為logkmax，來區(qū)分極強或強致敏劑與非致敏劑或中、弱致敏劑。實驗室驗證情況為了驗證本試驗方法的可行性，根據(jù)擬定的標(biāo)準(zhǔn)草案，本實驗室選擇了OECDTG442C及驗證文件中10個化合物作為驗證化合物，在本實驗室和四家外部實驗室開展實驗室驗證。實驗驗證結(jié)果基本一致，證實了本方法用于化妝品原料致敏性分級的適用性和可操作性。其他需說明的問題1.關(guān)于體例本試驗方法的體例主要參照現(xiàn)行《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）中第六章毒理學(xué)試驗方法的體例，便于化妝品檢驗領(lǐng)域相關(guān)檢驗人員的閱讀和實際操作。關(guān)于本方法的適用性動力學(xué)直接多肽反應(yīng)性試驗（kDPRA）是DPRA（OECDTG442C，DB-ALM方案154）的改良版。kDPRA使用半胱氨酸-肽消耗的動力學(xué)速率來區(qū)分GHS亞類1A(極強或強致敏劑)和非GHS亞類1A致敏劑(非致敏劑或中、弱致敏劑)兩種水平的皮膚致敏效力。此外，用該方法產(chǎn)生的動力學(xué)速率與致敏效力具有很強的定量相關(guān)性，因此可以在規(guī)定的方法（DA）中使用定量數(shù)據(jù)集成