T-SDSCA 0001-2024 人臍帶組織來源的間充質(zhì)干細胞制備與質(zhì)量控制

ICSCCS07.080C44SDSCAPreparationandqualitycontrolofhumanumbilicalcordtissuederivedmesenchymal2024-11-29發(fā)布IT/SDSCA0001—2024前言 32規(guī)范性引用文件 33術(shù)語和定義 34基本要求 34.1場地要求 34.2物料、設(shè)備和儀器 44.3人員管理 45制備過程 45.1樣本采集 45.2樣本運輸 55.3分離與培養(yǎng) 55.4凍存與復(fù)蘇 55.5關(guān)鍵質(zhì)量控制 66記錄 6附錄A（規(guī)范性）細胞存活率檢測細胞計數(shù)法 8附錄B（規(guī)范性）細胞表面標記物檢測流式細胞法 10附錄C（規(guī)范性）成骨分化檢測茜素紅S染色法 11附錄D（規(guī)范性）成脂分化檢測油紅O染色法 12附錄E（規(guī)范性）成軟骨分化檢測阿爾新藍染色法 13參考文獻 T/SDSCA0001—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由山東博森醫(yī)學工程技術(shù)有限公司提出。本文件由山東省干細胞學會歸口。本文件起草單位：組織細胞與再生醫(yī)學山東省工程研究中心、山東博森醫(yī)學工程技術(shù)有限公司、山東卡森細胞治療工程技術(shù)有限公司、山東大學第二醫(yī)院、山東大學齊魯醫(yī)院、山東省第三醫(yī)院、山東省立醫(yī)院。本文件主要起草人：陳義、孫明輝、滕藤、唐東起、程雷、單風平、葛汝村、劉瑜。3T/SDSCA0001—2024人臍帶組織來源的間充質(zhì)干細胞制備與質(zhì)量控制本文件描述了人臍帶組織來源的間充質(zhì)干細胞制備中場地要求、物料、設(shè)備和儀器、人員管理、樣本的采集運輸、細胞制備過程、關(guān)鍵質(zhì)量控制及記錄。本文件適用于人臍帶組織來源的間充質(zhì)干細胞的生產(chǎn)和檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB50591潔凈室施工及驗收規(guī)范GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T37864生物樣本庫質(zhì)量和能力通用要求T/CSCB0001干細胞通用要求中華人民共和國藥典3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1人臍帶組織來源的間充質(zhì)干細胞Mesenchymalstemcellsderivedfromhumanumbilicalcordtissue存在于新生兒臍帶組織中的一種多功能干細胞，貼壁培養(yǎng)后呈成纖維細胞樣形態(tài)（紡錘形和梭形）、可在體外自我更新并具有成骨、成脂、成軟骨等分化能力的干細胞。3.2潔凈操作區(qū)Cleanoperatingarea需要對環(huán)境中懸浮粒子及微生物數(shù)量進行控制的區(qū)域，其建筑結(jié)構(gòu)、裝備及其使用應(yīng)當能減少該區(qū)域內(nèi)污染物的引入、產(chǎn)生和滯留，區(qū)域內(nèi)溫度、濕度、壓力等其他參數(shù)按照要求受控。4基本要求4.1場地要求人臍帶組織來源的間充質(zhì)干細胞制備機構(gòu)實驗室或廠房應(yīng)由具有潔凈實驗室設(shè)計建設(shè)資質(zhì)的工程公司設(shè)計與建造，并應(yīng)符合GB50591的規(guī)定。建設(shè)完成后，各功能區(qū)域的潔凈級別應(yīng)由專業(yè)機構(gòu)進行檢測并出具合格證明。4T/SDSCA0001—20244.2物料、設(shè)備和儀器4.2.1物料人臍帶組織來源的間充質(zhì)干細胞的制備機構(gòu)應(yīng)優(yōu)先選用符合T/CSCB0001《干細胞通用要求》的原材料及輔料。并對物料供應(yīng)商進行審核，要求供應(yīng)商提供產(chǎn)品質(zhì)量報告和批次檢驗報告，并對物料進行質(zhì)量抽檢，避免不合格產(chǎn)品引入后續(xù)使用過程。在細胞制備過程中所用的培養(yǎng)基應(yīng)具有足夠的純度并符合無菌、無致病微生物及內(nèi)毒素的質(zhì)量標準，若使用商業(yè)來源培養(yǎng)基，應(yīng)盡量采用GMP級別的培養(yǎng)基并提供相關(guān)質(zhì)量合格證明。4.2.2設(shè)備和儀器人臍帶組織來源的間充質(zhì)干細胞制備機構(gòu)的設(shè)備和儀器正式使用前應(yīng)做安裝確認，關(guān)鍵設(shè)備定期進行第三方校準，不應(yīng)使用有安全隱患的儀器操作樣本。制備機構(gòu)應(yīng)對設(shè)備和儀器應(yīng)進行編號建檔，并建立標準操作流程（SOP），確保使用、運行、保養(yǎng)、維修記錄完整，及時對狀態(tài)異常的設(shè)備進行校對和維修。4.3人員管理4.3.1人臍帶組織來源的間充質(zhì)干細胞制備機構(gòu)應(yīng)分別設(shè)立干細胞制備負責人、質(zhì)量管理負責人和質(zhì)量受權(quán)人崗位。由法人授權(quán)任命，并定期接受崗位專業(yè)培訓，質(zhì)量管理負責人和制備技術(shù)負責人不應(yīng)互相兼任，質(zhì)量管理負責人和質(zhì)量受權(quán)人可以兼任。直接從事人臍帶組織來源的間充質(zhì)干細胞制備和質(zhì)控技術(shù)人員、采集人員應(yīng)具備的健康要求：HBsAg和針對HAV、HCV、HIV及梅毒的抗體及必要的微生物篩查，檢測結(jié)果應(yīng)為陰性。4.3.2直接接觸人臍帶組織來源的間充質(zhì)干細胞人員應(yīng)每年接受體檢一次，有呼吸道感染、發(fā)熱或體表有傷口等疾病狀態(tài)下不應(yīng)進入潔凈操作區(qū)，需完全康復(fù)后方可恢復(fù)崗位操作。4.3.3人臍帶組織來源的間充質(zhì)干細胞制備和質(zhì)控技術(shù)人員應(yīng)具備本科及以上學歷，生物技術(shù)、生物工程、醫(yī)學或藥學相關(guān)專業(yè)，上崗前應(yīng)經(jīng)過專業(yè)培訓，內(nèi)容包括但不限于干細胞理論與實踐、干細胞法律法規(guī)、細胞培養(yǎng)基礎(chǔ)、生物安全、儀器設(shè)備使用與維護方法、物料管理與清潔衛(wèi)生、崗位職責、操作規(guī)范等內(nèi)容。5制備過程5.1樣本采集5.1.1通則5.1.1.1樣本采集與處理應(yīng)符合GB/T37864的要求。5.1.1.2采集和處理程序可供樣本采集人員使用。5.1.1.3應(yīng)具備相關(guān)的資質(zhì)和設(shè)施環(huán)境。5.1.1.4應(yīng)符合國內(nèi)認可的倫理和當?shù)氐姆煞ㄒ?guī)。5T/SDSCA0001—20245.1.1.5應(yīng)建立適當?shù)馁|(zhì)量管理體系確保符合用戶需求并持續(xù)改進。5.1.2供者要求對供者（新分娩產(chǎn)婦）的一般信息、既往病史、家族史等進行資料采集，要求供者無家族遺傳病、無惡性腫瘤疾病史、無感染性疾病、無自身免疫性疾病、無特定病毒感染（乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病、巨細胞病毒、EB病毒等）。5.1.3采集場所及人員采集場所應(yīng)達到II級潔凈手術(shù)室要求。采集人員應(yīng)經(jīng)過相應(yīng)的技術(shù)培訓。5.1.4采集過程5.1.4.1臍帶標本采集嚴格按照國家執(zhí)業(yè)醫(yī)師實踐技能規(guī)范化標本進行操作，采集的器具應(yīng)保證無菌。5.1.4.2采集器具應(yīng)具有唯一標識碼、采集時間、采集醫(yī)生、內(nèi)容物等信息，放置2℃~8℃冰箱保存，并聯(lián)系運輸人員及時運輸至細胞制備中心或細胞制備實驗室。5.2樣本運輸5.2.1運輸容器應(yīng)將溫度維持在2℃~8℃,在運輸?shù)綄嶒炇仪按_保其處于有效運行狀態(tài)。5.2.2樣本運輸宜采用平穩(wěn)、安全、快速的運輸途徑，宜采用冷藏運輸車或?qū)Ｓ脴吮纠洳剡\輸箱運輸。5.2.3運輸過程中應(yīng)防滲漏、防輻射、抗震動、耐壓、耐熱等，樣本包裝應(yīng)貼上唯一標識碼，且應(yīng)標明樣本的基本信息，至少包括采集日期、采集人等信息。5.3分離與培養(yǎng)5.3.1新生兒臍帶剝離華通氏膠，以組織塊貼壁法或膠原酶消化法分離人臍帶組織來源的間充質(zhì)干細胞。5.3.2為保證細胞生長所必需的營養(yǎng)水平以及消除代謝產(chǎn)生的毒害作用，應(yīng)結(jié)合細胞所處環(huán)境穩(wěn)定性綜合考慮是否進行換液，并嚴格把控質(zhì)量。一般首次換液需要鏡下觀察到原代細胞完全貼壁和延展后方可進行，一般在原代細胞培養(yǎng)的第4天左右進行。5.3.3人臍帶組織來源的間充質(zhì)干細胞融合度達到80%～90%可進行傳代操作。傳代操作一般采用酶消化法將貼壁細胞消化吹散，再用終止劑終止消化，離心后用培養(yǎng)基重懸細胞，再根據(jù)密度傳代。5.3.4分離與培養(yǎng)過程中應(yīng)標識細胞的名稱、代次、批次、操作日期、操作人員姓名等信息。5.3.5分離及傳代過程中各批次細胞應(yīng)進行必要的質(zhì)量控制，質(zhì)量控制項目至少應(yīng)包括細胞形態(tài)、無菌、支原體、細胞數(shù)量及活率、細胞表面標記物等。5.3.6操作過程應(yīng)嚴格控制細胞質(zhì)量，確保無外源因子污染。5.4凍存與復(fù)蘇5.4.1凍存與復(fù)蘇過程應(yīng)嚴格按照相應(yīng)的操作規(guī)程操作，嚴格控制細胞質(zhì)量，確保無外源因子污染。5.4.2凍存過程宜遵循梯度或程序降溫原則。5.4.3復(fù)蘇過程應(yīng)根據(jù)細胞的使用目的進行冷凍保護液的洗滌。6T/SDSCA0001—20245.4.4凍存復(fù)蘇過程中應(yīng)標識細胞的名稱、代次、批次、操作日期、操作人員姓名等信息。5.5關(guān)鍵質(zhì)量控制5.5.1細胞形態(tài)人臍帶組織來源的間充質(zhì)干細胞貼壁培養(yǎng)時細胞形態(tài)應(yīng)呈紡錘形和梭形的成纖維細胞樣。5.5.2無菌檢測按照《中華人民共和國藥典》中1101無菌檢測法執(zhí)行，細菌和真菌檢測結(jié)果都應(yīng)為陰性。5.5.3支原體檢測按照《中華人民共和國藥典》3301支原體檢查法執(zhí)行，支原體檢測結(jié)果應(yīng)為陰性。5.5.4細胞存活率按照附錄A的方法檢測，未凍存細胞存活率應(yīng)大于或等于90%。5.5.5內(nèi)外源致病因子采用ELISA檢測法，HIV抗體、HBsAg、HCV抗體、TP抗體、CMV-IgM、HTLV抗體、HPV抗體、HHV抗體、EBV抗體檢測應(yīng)為陰性；采用核酸檢測法，HCV、HBV、HIV病毒核酸檢測應(yīng)為陰性。5.5.6表面標記物按照附錄B的方法檢測，CD105、CD73、CD90陽性率均應(yīng)大于或等于95%;CD11b、CD19、CD31、CD34、CD45、HLA-DR陽性率均應(yīng)小于或等于2%。5.5.7多向分化潛能5.5.7.1成骨分化按照附錄C的方法檢測，人臍帶組織來源的間充質(zhì)干細胞應(yīng)具有成骨分化潛能。5.5.7.2成脂分化按照附錄D的方法檢測，人臍帶組織來源的間充質(zhì)干細胞應(yīng)具有成脂分化潛能。5.5.7.3成軟骨分化按照附錄E的方法檢測，人臍帶組織來源的間充質(zhì)干細胞應(yīng)具有成軟骨分化潛能。6記錄原始記錄應(yīng)確保其可追溯細胞分離、處理和儲存操作所有環(huán)節(jié)，記錄內(nèi)容包含但不限于以下信息：a)供者唯一身份辨識符，如果適用；b)產(chǎn)品描述碼、采集類型和分類碼；c)產(chǎn)品名稱和組分；d)采集日期和時間；e)生產(chǎn)制備機構(gòu)的名稱和地址；f)制備過程中關(guān)鍵步驟的細節(jié)及結(jié)果；g)關(guān)鍵步驟的日期和時間，如果適用；7T/SDSCA0001—2024h)每一步驟的操作人員姓名及復(fù)核人；i)在分離、處理、制備過程中使用的關(guān)鍵物料的名稱、生產(chǎn)商、批號、有效期限；j)使用試劑的數(shù)量；k)使用設(shè)備編碼。8T/SDSCA0001—2024細胞存活率檢測細胞計數(shù)法A.1儀器和設(shè)備A.1.1明視場顯微鏡。A.1.2血球計數(shù)板。A.2試劑除特別說明外，所用試劑均為分析純，檢測用水均為18.2MΩ·cm（電阻率單位）去離子水。A.2.1磷酸鹽緩沖液：pH為7.4。A.2.2臺盼藍染液：使用時，用磷酸鹽緩沖液(A.2.1)稀釋至0.4%(質(zhì)量濃度)。A.3檢測步驟A.3.1細胞懸液制備收集待檢測細胞，用磷酸鹽緩沖液(A.2.1)配制細胞懸液，稀釋至合適的濃度。每個血球計數(shù)板(A.1.2)的1mm2的方格中的細胞的數(shù)量應(yīng)為20個～50個細胞。如果高于200個細胞，則需要進行稀釋。A.3.2細胞染色按1:1的體積比將臺盼藍染液(A.2.2)與細胞懸液(A.3.1)混合均勻。A.3.3細胞計數(shù)將蓋玻片蓋在血球計數(shù)板(A.1.2)計數(shù)槽上，取10μL混合液(A.3.2)滴在一側(cè)計數(shù)室的蓋玻片邊緣，另取10μL混合液，滴在另一側(cè)計數(shù)室的蓋玻片邊緣，使混合液充滿蓋玻片和計數(shù)板之間，靜置30s,將計數(shù)板置于明視場顯微鏡(A.1.1)下對被染色的細胞和細胞總數(shù)分別進行計數(shù)。對16×25規(guī)格的計數(shù)室，按對角線位，取左上、右上、左下、右下4個1mm2的中格(即100個小格)計數(shù)。對25×16規(guī)格的計數(shù)室，按對角線位，取左上、右上、左下、右下和中央5個中格(即80個小格)計數(shù)。當遇到位于大格線上的細胞，一般只計數(shù)大方格的上方和左線上的細胞(或只計數(shù)下方和右方線上的細胞)。按照步驟A.3.2～A.3.3再重復(fù)測定一個樣品。A.3.4細胞存活率計算細胞存活率計算公式如下：X=×100%9T/SDSCA0001—2024X——細胞存活率；M——細胞總數(shù)；S——染色的細胞數(shù)。計算兩次計數(shù)細胞存活率結(jié)果的平均值，記為細胞平均存活率。A.4精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不應(yīng)超過算術(shù)平均值的10%。T/SDSCA0001—2024（規(guī)范性）細胞表面標記物檢測流式細胞法B.1儀器和設(shè)備B.1.1流式細胞儀。B.1.2水平離心機。B.1.3電子天平。B.2試劑本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實驗用水均為GB/T6682規(guī)定的一級水。B.2.1磷酸鹽緩沖液：pH為7.4。B.2.2牛血清白蛋白(BSA):純度≥98%。B.2.3疊氮鈉(NaN?)。B.2.4抗人CD105、CD73、CD90、CD11b、CD19、CD31、CD34、CD45、HLA-DR抗體及同型對照抗體。B.2.5按照相應(yīng)要求使用電子天平(B.1.3)配制流式檢測所需的液體：洗滌液、抗體稀釋液。B.3樣品保存洗滌液和標記后的樣品于2～8℃保存。相關(guān)抗體遵照說明書保存。B.4檢測步驟B.4.1樣品準備收集細胞，使用水平離心機(B.1.2)300g離心4min,棄上清。然后用洗滌液清洗一遍，使用水平離心機(B.1.2)300g離心4min,棄上清。B.4.2抗體孵育按照抗體說明書進行稀釋使用?？贵w孵育結(jié)束后用洗滌液清洗兩遍，使用水平離心機(B.1.2)300g離心4min,棄上清。B.4.3過濾上機用洗滌液重懸細胞，然后通過40μm濾網(wǎng)轉(zhuǎn)移到流式管中，按流式細胞儀(B.1.1)應(yīng)用手冊上機檢測。B.4.4圈門設(shè)定原則首先根據(jù)細胞大小和顆粒度設(shè)門圈出目標細胞分群1,排除死細胞和其他雜細胞，然后根據(jù)Isotype對照組熒光強度，在分群1的基礎(chǔ)上畫出陽性細胞群2,排除沒有被熒光抗體標記的陰性細胞?？贵wIsotype作為陰性對照。B.5結(jié)果分析得到的檢測結(jié)果用軟件綜合分析，具體參考其軟件使用說明。T/SDSCA0001—2024（規(guī)范性）成骨分化檢測茜素紅S染色法C.1儀器和設(shè)備C.1.1血球計數(shù)板。C.1.2明視場顯微鏡。C.1.3水平離心機。C.2試劑本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實驗用水均為GB/T6682規(guī)定的一級水。C.2.1磷酸鹽緩沖液：pH為7.4。C.2.2消化酶。C.2.3臺盼藍染液：使用時，用磷酸鹽緩沖液(C.2.1)稀釋至0.4%(質(zhì)量濃度)。C.2.4成骨誘導液。C.2.5茜素紅S染色試劑盒。C.3檢測步驟C.3.1細胞樣品的準備C.3.1.1細胞消化使用水平離心機(C.1.3)離心收集細胞于離心管中，用無菌磷酸鹽緩沖液輕輕重懸細胞，避免形成氣泡或者殘留細胞團塊。C.3.1.2細胞計數(shù)根據(jù)附錄A方法測定，使用血球計數(shù)板(C.1.1)及明視場顯微鏡(C.1.2)計算細胞懸液活細胞濃度。C.3.2細胞接種并誘導細胞接種方式、密度及誘導步驟均遵循成骨誘導液產(chǎn)品說明書。誘導14d～21d。C.3.3鈣結(jié)節(jié)染色鈣結(jié)節(jié)染色根據(jù)茜素紅S染色試劑盒說明書進行。C.4結(jié)果分析顯微鏡下可見散在大量橘紅色的鈣結(jié)節(jié)。T/SDSCA0001—2024（規(guī)范性）成脂分化檢測油紅O染色法D.1儀器和設(shè)備D.1.1血球計數(shù)板。D.1.2明視場顯微鏡。D.1.3水平離心機。D.2試劑本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實驗用水均為GB/T6682規(guī)定的一級水。D.2.1磷酸鹽緩沖液：pH為7.4。D.2.2消化酶。D.2.3臺盼藍染液：使用時，用磷酸鹽緩沖液(D.2.1)稀釋至0.4%(質(zhì)量濃度)。D.2.4成脂誘導液。D.2.5油紅O染色試劑盒。D.3檢測步驟D.3.1細胞樣品的準備D.3.1.1細胞消化使用水平離心機(D.1.3)離心收集細胞于離心管中，用無菌磷酸鹽緩沖液輕輕重懸細胞，避免形成氣泡或者殘留細胞團塊。D.3.1.2細胞計數(shù)根據(jù)附錄A方法測定，使用血球計數(shù)板(D.1.1)及明視場顯微鏡(D.1.2)計算細胞懸液活細胞濃度。D.3.2細胞接種并誘導細胞接種方式、密度及誘導步驟均遵循成脂誘導液產(chǎn)品說明書，誘導14d～21d。D.3.3脂滴染色脂滴染色根據(jù)油紅O染色試劑盒說明書進行。D.4結(jié)果分析顯微鏡下可見橙紅色的脂滴，脂肪細胞中含大小不等的脂滴。T/SDSCA0001—2024成軟骨分化檢測阿爾新藍染色法E.1儀器和設(shè)備E.1.1血球計數(shù)板。E.1.2明視場顯微鏡。E.1.3水平離心