基因工程的基本操作程序（第3課時）-高二下學期生物人教版選擇性必修3

第2節(jié)

基因工程的基本操作程序第3課時1.目的基因的篩選和獲取-前提利用PCR獲取和擴增人工合成2.構建基因表達載體-核心目的基因、啟動子、終止子、標記基因3.將目的基因?qū)胧荏w細胞-關鍵農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(植物)、顯微注射法(動物)、

感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化法(微生物);4.目的基因的檢測與鑒定-保證分子檢測：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯個體水平：是否具有抗性以及抗性強度等基因工程的基本操作程序檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體DNA上是否插入了目的基因方法：PCR等技術提取DNA根據(jù)目的基因的序列設計PCR引物PCR操作是否擴增出目的基因瓊脂糖凝膠電泳DNA測序技術你知道PCR會擴增出哪些不同的片段嗎？只含目的基因片段目的基因在整個DNA片段的中央位置復制3次后這兩個DNA分子量相同嗎？種類1種類2種類3種類4種類5怎么鑒定PCR的產(chǎn)物？電泳?、貾CR利用了DNA的熱變性原理，通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結合。PCR儀實質(zhì)上就是一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器，一次PCR一般要經(jīng)歷30次循環(huán)。②PCR擴增DNA片段還利用了DNA半保留復制的原理。探究·實踐：DNA片段的擴增及電泳鑒定1.實驗原理(1)PCR在體外進行DNA片段的擴增原理(2)DNA片段電泳鑒定的原理①DNA分子具有____________，在一定的____下，這些基團可以帶上________________。在_________的作用下，這些___________會向著__________________的電極移動，這個過程就是電泳?？山怆x的基團pH正電荷或負電荷帶電分子與它所帶電荷相反電場②PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構象等有關。③凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來。一般使用的電泳緩沖液pH=8，DNA分子帶負電荷，在電場中DNA便向正極移動。電泳：

在電場的作用下，DNA、RNA、蛋白質(zhì)等這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。正極負極電場力瓊脂糖凝膠濃度（%）分離DNA分子大小（Kb）遷移速率0.61～20慢快0.70.8～100.90.5～71.20.4～61.50.2～42.00.1～3瓊脂糖凝膠濃度越大，分離的DNA分子越小，遷移速率越快DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度關系PCR儀2.材料用具①PCR儀（自動控溫，實現(xiàn)DNA的擴增）②微量離心管（實際上是進行PCR反應的場所）③微量移液器（用于向微量離心管轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體）④一次性吸液槍頭（微量移液器吸取一種試劑更換一次槍頭）⑤電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）(1)用具：微量離心管2.材料用具①4種脫氧核苷酸等量混合液、2種引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、擴增緩沖液、無菌水、電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液、瓊脂糖和核酸染料等。②PCR反應體系的配方(見教材)。(2)材料：PCR反應體系的配方10倍濃縮的擴增緩沖液(含Mg2+)5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液(實為dNTP)1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1～5U/μL的TaqDNA聚合酶(即為耐高溫的DNA聚合酶)1～2U模板DNA(1pg～1μg)5～10μL總體積50μL三點提醒在PCR過程中實際加入的為dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作為合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量。引物既可以是DNA單鏈，也可以為RNA單鏈。細胞內(nèi)的DNA進行復制時，也需要引物，一般為RNA片段；PCR引物一般為DNA片段。真核細胞和細菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反應緩沖溶液中一般要添加Mg2＋。1233.方法步驟(1)DNA片段的擴增用微量移液器按照PCR反應體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分。待所有組分都加入后，蓋嚴離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機里，離心約10s，使反應液集中在離心管的底部（提高反應速率）。使DNA充分變性，以利于引物更好地與模板結合。循環(huán)程序變性復性延伸預變性94℃，5min30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1min參照下表的參數(shù)，設置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應液的微量離心管放入PCR儀中進行反應。移液離心擴增PCR實驗操作過程[思考]為什么最后1次變性時間延長？

TaqDNA聚合酶活性會隨著循環(huán)次數(shù)增加而下降。在每一輪循環(huán)中，部分片段可能沒有完全延伸完，TaqDNA聚合酶就脫落了。最后1次變性時間延長，讓這些DNA打開，重新延伸。3.方法步驟(2)DNA片段的電泳鑒定配制瓊脂糖溶液根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。制備凝膠加樣電泳觀察記錄

常用的核酸染色劑有EB(溴化乙錠)、GoldView等，EB能插入DNA分子中的堿基對之間，導致EB與DNA結合。嵌入核酸堿基間的EB能吸收300nm波長的紫外光，發(fā)出可見熒光。其熒光強度與DNA分子的含量成正比。(2)DNA片段的電泳鑒定配制瓊脂糖溶液根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。制備凝膠將溫熱的瓊脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜。加樣電泳觀察記錄(2)DNA片段的電泳鑒定配制瓊脂糖溶液根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。制備凝膠將溫熱的瓊脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜。加樣將擴增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個加樣孔加入指示分子大小的標準參照物。電泳觀察記錄(2)DNA片段的電泳鑒定配制瓊脂糖溶液根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。制備凝膠將溫熱的瓊脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜。加樣將擴增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個加樣孔加入指示分子大小的標準參照物。電泳接通電源，根據(jù)電泳槽陽極至陰極之間的距離來設定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳。觀察記錄取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。DNA片段的電泳結果①為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。②該實驗所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應分裝成小份，并在-20℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。③在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。④在進行操作時，一定要戴好一次性手套。⑤PCR擴增不能隨意加大試劑用量。4.操作提示(1)你是否成功擴增出DNA片段？判斷的依據(jù)是什么？

可以在紫外燈下直接觀察到DNA條帶的分布及粗細程度來評價擴增的結果。

若出現(xiàn)一條條帶，表明PCR擴增是成功的。5.結果分析與評價

如果擴增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反應成分，各反應成分的用量不當，PCR程序設置不當?shù)?。如果擴增結果不止一條條帶，可能的原因有：引物設計不合理，它們與非目的序列有同源性或容易形成二聚體；復性溫度過低；DNA聚合酶的質(zhì)量不好等。5.結果分析與評價(2)如果擴增不成功，可能的原因有？如果不止一條條帶，請分析產(chǎn)生這個結果的可能原因。1.用PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因植株是否成功導入目的基因時，得到以下電泳圖譜，其中1號為DNA標準樣液(Marker)，10號為蒸餾水。PCR時加入的模板DNA如圖所示。據(jù)此做出分析不合理的是(

)A.PCR產(chǎn)物的分子大小在250至500bp之間B.3號樣品為不含目的基因的載體DNAC.9號樣品對應植株不是所需的轉(zhuǎn)基因植株D.10號的電泳結果能確定反應體系等對實驗結果沒有干擾B2．下列有關電泳的敘述，錯誤的是（

）

A．電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程

B．待測樣品中DNA分子的大小和構象、凝膠的濃度等都會影響DNA

在電泳中的遷移速率

C．進行電泳時，帶電分子會向著與其所帶電荷相同的電極移動

D．PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定C3.下圖為轉(zhuǎn)基因抗凍番茄培育過程的示意圖（其中ampr為抗氨芐青霉素基因）。下列敘述錯誤的是（）A．④過程中可利用目的基因作為探針對植株進行篩選B．可同時選用限制酶PstI、SmaI對含目的基因的DNA進行剪切C．過程②可采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將含目的基因的表達載體導入受體細胞D．質(zhì)粒上的抗性基因有利于篩選含目的基因的細胞和促進目的基因的表達D4.設計引物是PCR技術關鍵步驟之一。某同學設計的兩組引物(只標注了部分堿基序列)都不合理(如下圖)，請分別說明理由。(1)第1組：

；

第2組：