T-CSTM 00995-2024 T-CAIA SHO22-2024 人全血糖化血紅蛋白HbA1C 含量基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜法

ICS11.020CCSC50T/CSTM00995—2024/THumanwholeblood—ContentofglycosylatedhemoglobinHbA1C—Matrix-assistedlaserdesorptionionization–timeofflightmassspectromet2024-10-31發(fā)布中關村材料試驗技術聯(lián)盟中國分析測試協(xié)會T/CSTM00995—2024/T/CAI本文件參照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》，GB/T20001.4-2015《標準編寫規(guī)則第4部分：試驗方法標準》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。T/CSTM00995-2024與T/CAIASHO22—2024一致程度為等同（IDT）。本文件由中國材料與試驗標準化委員會科學試驗標準化領域委員會（CSTM/FC98）和中國分析測試協(xié)會共同提出。本文件由中國材料與試驗標準化委員會科學試驗領域科學試驗創(chuàng)新方法標準化技術委員會（CSTM/FC98/TC02）和中國分析測試協(xié)會共同歸口。2T/CSTM00995—2024/T/CAIHbA1C占總糖化血紅蛋白的60%-85%，是糖化血紅蛋白的主要組成成分，系2型糖尿病的臨床輔助診斷及監(jiān)測指標。HbA1C由葡萄糖的游離醛基與血紅蛋白的β鏈N末端纈氨酸的氨基經非酶促結合反應，先形成不穩(wěn)定的醛亞胺（Schiff堿），然后經過葡糖胺重排，最后形成穩(wěn)定的酮胺化合物。HbA1C的含量主要取決于血糖濃度及血糖與血紅蛋白的接觸時間，可以反映采血前120天內的平均血糖水平，個體內生物學變異小于2%。本文件規(guī)定的方法直接檢測β珠蛋白及糖基化修飾β珠蛋白，無需蛋白內切酶Glu-C酶切等實驗步驟。所測標志物與國際臨床化學和實驗室醫(yī)學聯(lián)盟（InternationalFederationofClinicalChemistryandLaboratoryMedicine,IFCC）對糖化血紅蛋白HbA1C含量檢測的定義相同，并且能有效地區(qū)分和識別多種血紅蛋白變體。3T/CSTM00995—2024/T/CAI重要提示：使用本文件的人員應有正規(guī)實驗室工作的實踐經驗。本文件并未指出所有可能的安全問題。使用者有責任采取適當的安全和健康措施，并保證符合國家有關法規(guī)規(guī)定的條件。本文件規(guī)定了利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜檢測人全血糖化血紅蛋白HbA1C含量的方法，包括試劑配制、樣品制備、儀器檢測、數據分析等。本文件適用于臨床實驗室及從事流行病學研究的實驗室，對新鮮或冷凍人全血糖化血紅蛋白HbA1C含量的檢測（NGSP），線性范圍為3.45%~19.50%。其他用途也可參照使用。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6379.1測量方法與結果的準確度（正確度與精密度）第1部分：總則與定義GB/T6379.2測量方法與結果的準確度（正確度與精密度）第2部分：確定標準測量方法重現(xiàn)性與再現(xiàn)性的基本方法GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T20001.4標準編寫規(guī)則第4部分：試驗方法標準GB/T38576人類血液樣本采集與處理JJF1528飛行時間質譜儀校準規(guī)范WS/T408臨床化學設備線性評價指南WS/T461糖化血紅蛋白檢測3術語和定義WS/T408和WS/T461界定的以及下列術語和定義適用于本文件。3.1驗證verification通過提供客觀證據對規(guī)定要求已得到滿足的認定。[來源：WS/T461-2015，定義3.2]3.24T/CSTM00995—2024/T/CAI糖化血紅蛋白hemoglobinA1C；HbA1C血液中葡萄糖與血紅蛋白1個或2個β鏈N末端纈氨酸反應，發(fā)生不可逆糖基化所形成的穩(wěn)定化合，全稱為：血紅蛋白β鏈(血液)-N-(1-脫氧果糖-1-基)血紅蛋白β鏈。[來源：WS/T461-2015，定義3.3，有修改]3.3線性linearity在給定的測量范圍內，使測定結果與分析物的量直接成比例的能力。注：此處的測定結果指最終的分析結果，而非儀[來源：WS/T408-2012，定義2.2，有修改]3.4線性范圍linearrange使實驗系統(tǒng)的最終分析結果為可接受的線性的濃度范圍，此時非線性誤差應低于允許誤差。[來源：WS/T408-2012，定義2.3]4方法概述新鮮或冷凍的人全血樣品經稀釋液稀釋后，紅細胞破裂并釋放出其中的血紅蛋白分子，按一定比例與芥子酸（sinapicacid，SA)基質混和均勻后點在靶板上，干燥后加載到基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀（MALDI-TOFMS）中進行檢測（激光波長349nm）。采用外標法對樣品中的糖化血紅蛋白HbA1C含量進行定量。5試驗條件試驗溫度：20℃~25℃。相對濕度:40%RH～60%RH。6試劑和材料6.1試劑6.1.1水：GB/T6682定義的實驗室一級用水。6.1.2乙腈（ACN色譜純。6.1.3芥子酸（SA純度大于99.0%，適用于MALDI基質。6.1.4三氟乙酸（TFA色譜純。6.1.5糖化血紅蛋白HbA1C標準物質：量值可溯源的人全血基質血紅蛋白A1C標準物質。6.2溶液配制5T/CSTM00995—2024/T/CAI6.2.1稀釋液在500mL試劑瓶中加入500mL水和500μLTFA后旋緊瓶蓋，上下顛倒混勻3次。6.2.2基質液準確稱取20mgSA于15mL離心管中，加入4mLACN和6mL稀釋液（6.2.1），超聲大約5分鐘至固體粉末完全溶解，室溫、避光可保存1個月。6.2.3基質使用液在15mL離心管中加入5mL稀釋液（6.2.1）和5mL基質液（6.2.2）渦旋混勻30秒?，F(xiàn)用現(xiàn)配。6.3材料6.3.1離心管：0.6mL、1.5mL、15mL三種規(guī)格的聚丙烯離心管。6.3.2移液吸頭：1mL、200μL、10μL三種規(guī)格的移液吸頭，配套移液器使用。6.3.3試劑瓶：500mL的透明玻璃試劑瓶。6.3.4靶板：MALDI-TOFMS使用的孔徑為3.0mm的不銹鋼靶板。7儀器和設備7.1基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀7.1.1質量偏差要求外標法，血紅蛋白標準物質（m/z=15868），質量偏差容許≤500ppm，測試靶板全范圍質量準確度≤500ppm；儀器校準方法按JJF1528的規(guī)定。7.1.2質量分辨率要求血紅蛋白標準物質（m/z=15868）測試質量分辨率應≥800。儀器校準方法按JJF1528的規(guī)定。7.1.3靈敏度要求測試血紅蛋白標準物質，m/z=15868信噪比應>200。儀器校準方法按JJF1528的規(guī)定。7.2電子天平：感量0.0001g。7.3渦旋式混合器：速度范圍0-2500rpm。7.4微量移液器：最大量程1000μL、100μL、10μL和2.5μL各一支。7.5電加熱板（可選加熱溫度范圍5℃~380℃,傳感器控制精度±0.5℃。6T/CSTM00995—2024/T/CAI7.6超聲清洗儀：功率不低于250W，或相當的設備。8樣品8.1一般要求樣品采集與處理應符合GB/T38576的要求。8.2樣品采集采用含有乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝劑的采血管或毛細玻璃管，按照適用于臨床實驗室檢測的常規(guī)方法采集人全血樣品，采集人全血樣品不受飲食和采集時間的影響。8.3樣品用量樣品量應不少于15μL。8.4樣品保存及凍融新鮮人全血樣品于2℃~8℃保存時間不超過5天；冷凍人全血樣品于-70℃及以下溫度保存時間不超過1年。冷凍人全血樣品使用前應在室溫下融化、充分混勻。9試驗步驟9.1樣品處理取1.5mL離心管，加入995μL稀釋液（6.2.1），然后取5μL人全血樣品加入離心管中，渦旋混勻30秒，然后從中移取5μL加入0.6mL離心管中，加入45μL基質使用液（6.2.3渦旋混勻30秒，最后從中取2.5μL點在靶板的靶孔內，在室溫下自然干燥或39℃加熱干燥。每個樣品重復2次。9.2儀器參考采集條件9.2.1聚焦質量（FocusMassm/z15000。9.2.2采集質量范圍：m/z2000~m/z35000。9.2.3掃描速度：1mm/sec。9.2.4檢測器電壓：-0.66kV。9.2.5激光頻率：2000Hz。9.2.6激光能量：9.4μJ。9.2.7激光波長：349nm。9.3樣品測試T/CSTM00995—2024/T/C將載有樣品的靶板置于MALDI-TOFMS中，按照8.2儀器條件對標準物質和樣品進行檢測。9.4標準曲線制備9.4.1標準溶液配制將糖化血紅蛋白HbA1C含量≤3.45%和≥19.50%的兩個糖化血紅蛋白HbA1C高、低值標準物質分別用水稀釋200倍后，按照一定的比例混合得到5個糖化血紅蛋白HbA1C含量介于3.45%~19.50%之間的梯度濃度標準品，含量從低到高分別標記為L1、L2、L3、L4和L5。9.4.2數據采集分別移取45μL的基質使用液（6.2.3）于5個0.6mL的離心管中，再分別移取L1~L5梯度濃度標準品各5μL依次加入上述5個0.6mL的離心管中，渦旋混勻30秒后，從每個離心管中移取2.5μL點在靶板的相應靶孔內，在室溫下自然干燥或39℃加熱干燥后用MALDI-TOFMS按照8.2儀器條件進行數據采集。9.4.3標準曲線制備依據得到梯度濃度標準品質譜圖數據（見附錄A提取人全血血紅蛋白β珠蛋白峰面積和糖化β珠蛋白峰面積。以N末端纈氨酸糖基化修飾β珠蛋白（m/z=16030）的峰面積占總β珠蛋白峰面積（m/z=16030和m/z=15868）的百分比為橫坐標，以糖化血紅蛋白HbA1C含量為縱坐標，擬合得到定量標準曲線（線性擬合優(yōu)度R2≥0.990）。10試驗數據處理10.1結果計算依據得到的樣品質譜圖數據，提取人全血血紅蛋白β珠蛋白峰面積和糖化β珠蛋白峰面積，根據公式（1）計算得到N末端纈氨酸糖基化修飾β珠蛋白（m/z=16030）的峰面積占總β珠蛋白峰面積（m/z=16030和m/z=15868）的百分比，帶入8.4標準曲線制備擬合得到的定量標準曲線，計算得到糖化血紅蛋白HbA1C含量。式中：β珠蛋白糖化率—糖化β珠蛋白峰面積占總β珠蛋白峰面積的百分比，單位為%；SGlc-βHb—糖化β珠蛋白峰面積，單位為Vamu；SβHb—β珠蛋白峰面積，單位為Vamu。10.2結果表達以NGSP的傳統(tǒng)單位（%）報告糖化血紅蛋白HbA1C含量測定結果，可同時報告IFCC的國際單8T/CSTM00995—2024/T/CAI位制單位（mmol/mol）結果。結果保留小數點后2位。IFCC單位（mmol/mol）與NGSP（%）單位之間換算可參見公式（2）：式中：IFCC—國際臨床化學和檢驗醫(yī)學聯(lián)合會給糖化血紅蛋白定義的單位(mmol/mol)；NGSP—美國國家糖化血紅蛋白標準化計劃給糖化血紅蛋白定義的單位（%）。11精密度和測量不確定度11.1精密度本文件的精密度試驗由5個實驗室對5個水平的EDTA全血樣本糖化血紅蛋白進行測定。在GB/T6379.1規(guī)定的重復性條件下，每個實驗室對每個水平測定12次。具體的重復性限r和再現(xiàn)性限R見表表1糖化血紅蛋白測定方法的精密度HbA1C濃度范圍/%重復性限r/%再現(xiàn)性限R/%4.59～5.900.320.466.100.220.249.70～16.350.170.2211.2測量不確定度根據GB/T20001.4規(guī)定，使用者有需要時，可給出測量不確定度。但是，試驗方法不適用也無義務提供確切值以供使用者估算不確定度。測量不確定度應以使用試驗方法所得的樣品測試結果為基礎進行估算，并可與測試結果一起報告。建議以擴展不確定度的形式（測試結果±U的數字值）報告，需明確包含因子k的取值，通常k=2。12質量保證和控制建立標準曲線，需要用質控樣品確認標準曲線的有效性。在樣品檢測過程中，每次檢測都應對標準品和質控樣品進行檢測，如質控樣品測定值與參考值的偏倚大于參考值的10%，應重新建立標準曲線。標準品或質控樣品的含量以被測物附近的濃度為宜。質控樣品應與待測樣品具有相似的特性，并且有已知的濃度或含量，建議糖化血紅蛋白HbA1C含量在6.00%~6.50%之間。13試驗報告試驗報告應當包括下列（但不限于）內容：識別樣品、實驗室和試驗日期所需的全部資料；本文件編號；結果及其表示；試驗報告推薦模板見附錄B。T/CSTM00995—2024/T/CAI（資料性）糖化血紅蛋白HbA1C標準物質的質譜圖A.1糖化血紅蛋白HbA1C標準物質的質譜見圖A.1。圖A.1糖化血紅蛋白HbA1C標準物質的質譜圖（m/z2000~m/z35000）A.2糖化血紅蛋白HbA1C標準物質的質譜見圖A.2。圖A.2糖化血紅蛋白HbA1C標準物質的質譜圖（m/z14800~m/z16800）T/CSTM00995—2024/T/CAI（資料性）試驗報告推薦模板糖化血紅蛋白（HbA1C）檢驗結果報告單推薦模板見表B.1。表B.1糖化血紅蛋白（HbA1C）檢驗結果報告單標本條碼檢測單位送檢標本實驗號標本情況采樣時間接收時間操作人聯(lián)系電話項目結果(NGSP)單位結果（IFCC）單位%mmol/molT/CSTM00995—2024/T/CAI起草單位和主要起草人本文件起草單位：融智生物科技（青島）有限公司、北京大學深圳醫(yī)院、首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院、南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院、中國科學院生物物理研究所、中國農業(yè)大學、煙臺大學生命科學院、北京融智優(yōu)譜生物科技有限公司、杭州意誠默迪生物科技有限公司、上海伍豐科學儀器有限公司。本文件主要起草人：紀玲、李晨、李巖、李運濤、林建涵、馬雪婷、馬昱、宋合興、孫德慧、王緒敏、王玉璽、溫斌斌、吳軼、謝雯春、徐安平、張瑞、周宏偉、周曉光。T/CSTM00995—2024/T/CAI參考文獻[1]HanasR,JohnG.InternationalHbA1CConsensusCommittee.2010ConsensusstatementontheworldwidestandardizationofthehemoglobinA1Cmeasurement.ClinChemLabMed.2010,48:775-776.[2]IFCC.ApprovedIFCCreferencemethodforthemeasurementofHbA1Cinhumanblood.ClinChemLabMed.2002,40:78-89.[3]InternationalOrganizationforStandardization:Qualitymanagementinthemedicallaboratory.ISO15189:2000.[4]JonesW,ScottJ,LearyS,etal.Stabilityofwholebloodat-70℃formeasurementofhemoglobinA1Cinhealthyindividuals.ClinChem.2004,50:2460-2461.[5]LittleR.R,RohlfingC.L,HansonS,etal.Effectofhemoglobin(Hb)EandHbDtraitsonmeasurementsofglycatedHb(HbA1C)by23methods[J].ClinChem,2008,54(8):1277-1282.[6]MiedemaK.TowardsworldwidestandardisationofHbA1Cdetermination.Diabetologia.2004,47:1143-1148.[7]RobertsWL,PourSS,DEBK,etal.EffectsofhemoglobinCandStraitsonglycohemoglobinmeasurementsbyelevenmethods.ClinChem.2005,51:776-777.[8]StephenJ.Hattan,KennethC.Parker,etal.AnalysisandQuantitationofGlycatedHemoglobinbyMatrixAssistedLaserDesorption/IonizationTimeofFlightMassSpectrometry.AmericanSocietyforMassSpectrometry,2016,10.1007/s13361-015-1316-6.[9]WorldHealthorganization.Useofglycatedhaemoglobin(HbA1C)inthediagnosisofdiabetesmellitus:abbreviatedreportofaWHOconsultation.Geneva.2011:1-25.[10]XuA.P,WeiJ.X.etal.PotentialofMALDI-TOFmassspectrometrytoovercometheinterferenceofhemoglobinvariantsonHbA1Cmeasurement.ClinChemLabMed.2020,59:233-239.[11]XuA.P,WangY.J.etal.EvaluationofMALDI-TOFMSforthemeasurementofglycatedhemoglobin.ClinicaChimicaActa.2019,498:154–160.[12]XuA.P,WangY.J.etal.DetectionofH