水產(chǎn)品中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的快速檢測(cè) 拉曼光譜法

1T/FJBR000-2021水產(chǎn)品中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的快速篩選測(cè)定拉曼光譜法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了使用便攜式拉曼光譜儀檢測(cè)水產(chǎn)品中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于各種魚蝦等水產(chǎn)品中可食用部位恩諾沙星和環(huán)丙沙星的篩選檢測(cè)。本標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定水產(chǎn)品中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的檢出限為10μg/kg。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682—2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T30891—2014水產(chǎn)品中抽樣規(guī)范附錄BGB/T40219—2021拉曼光譜儀通用規(guī)范3術(shù)語(yǔ)和定義GB/T40219—2021規(guī)定的術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。4原理通常，不同物質(zhì)具有與其分子結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)的特征拉曼（Raman）光譜。當(dāng)引入具有表面增強(qiáng)拉曼光譜（簡(jiǎn)稱SERS）效應(yīng)的納米增強(qiáng)試劑時(shí)，物質(zhì)的拉曼信號(hào)將得到顯著性增強(qiáng)。取適量魚蝦等水產(chǎn)品中可食部位勻漿后的樣品，經(jīng)溶劑提取、凈化與富集，加表面增強(qiáng)拉曼光譜（簡(jiǎn)稱SERS）增強(qiáng)試劑有效增強(qiáng)目標(biāo)物的拉曼信號(hào)，進(jìn)行拉曼光譜掃描。根據(jù)恩諾沙星和環(huán)丙沙星的拉曼特征譜峰532±6cm-1、552±6cm-1、651±6cm-1、737±6cm-1和785±6cm-1（參見附錄A）進(jìn)行結(jié)果判定：有特征峰出現(xiàn)為陽(yáng)性，否則為陰性或含量低于檢出限。5試劑和材料除另有規(guī)定，所用試劑均為分析純，SERS增強(qiáng)試劑合成用水應(yīng)符合GB/T6682-2008中的一級(jí)要求，其他實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682—2008中二級(jí)水要求，具體試劑與材料如下：——乙腈(CH3CN）；——?dú)溲趸c(NaOH)；——鹽酸（HCl）；——鹽酸溶液（1mol/L量取濃鹽酸9mL，倒入預(yù)先盛有適量水的試劑瓶中，加水定容至100mL；——碘化鉀(KI)；——碘化鉀溶液（1mol/L）:稱取16.6g碘化鉀加水定容至100mL；2T/FJBR000-2021——氯化鈉（NaCl）；——氯化鈉溶液（20%）：稱取20g氯化鈉加水定容至100mL；——硝酸銀（AgNO3——硝酸銀溶液（1mmol/L）；取0.17g硝酸銀加水（一級(jí)水）定容至1L；——檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7——檸檬酸三鈉（1%）：取1g檸檬酸三鈉加水（一級(jí)水）定容至100mL；——無(wú)水硫酸鈉（Na2SO4——SERS增強(qiáng)試劑：納米銀濃縮液，或相當(dāng)者；——納米銀濃縮液：取200mL1mmol/L硝酸銀水溶液加熱沸騰，劇烈攪拌下逐滴準(zhǔn)確滴加5.0mL1%檸檬酸三鈉水溶液，持續(xù)煮沸1h，溶液變?yōu)榛揖G色，冷卻到室溫即為納米銀溶膠。取1mL納米銀溶膠于1.5mL離心管中，8000r/min離心5min，棄去上清液，吸取底層濃縮液體100μL，即為納米銀濃縮液?！髦Z沙星標(biāo)準(zhǔn)品（enrofloxacin，93106-60-6，C19H22FN3O3，純度≥99%）；——環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品（ciprofloxacin，85721-33-1，C17H18FN3O3，純度≥99%——恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)工作液（100ng/mL取100μL濃度為100μg/mL恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品于100mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為100ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。于4oC避光保存，有效期一個(gè)月；——環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)工作液（100ng/mL取100μL濃度為100μg/mL環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品于100mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為100ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。于4oC避光保存，有效期一個(gè)月。6儀器和設(shè)備6.1便攜式拉曼光譜儀：發(fā)射波長(zhǎng)為785±0.5nm，線寬＜0.1nm，能量≥250mW；光譜分辨率≤12cm-1；光譜響應(yīng)范圍300cm-1～1800cm-1，或大于該響應(yīng)范圍。6.2具塞聚丙烯離心管：1.5mL、5mL、50mL。6.3高速離心機(jī)：1.5mL，轉(zhuǎn)速不低于8000r/min。6.4組織搗碎機(jī)。6.5渦旋振蕩器。6.6電子天平：感量0.01g。6.7樣品池：8×30mm玻璃管，1.0mL。7分析步驟7.1樣品前處理7.1.1試樣制備按照GB/T30891—2014水產(chǎn)品中抽樣規(guī)范附錄B的要求，取可食部分用組織搗碎機(jī)(6.4)勻漿，備用。如不能及時(shí)檢測(cè)，應(yīng)在-18℃以下保存?zhèn)溆谩?.1.2提取稱取2g（精確至0.01g）勻漿的樣品于50mL具塞離心管中，加入5mL乙腈，在渦旋振蕩器（6.5）上振蕩2min，靜置分層。移取1mL上清液于5mL具塞離心管中，加入2mL乙腈，再加入1g無(wú)水硫酸鈉，渦旋振蕩10~20s，靜置1min。移取1mL上清液于5mL具塞離心管中，加入1mL氯化鈉溶液（20%），渦旋振蕩10~20s，靜置分層，下層溶液作為待測(cè)液備用。3T/FJBR000-20217.2樣品測(cè)定7.2.1拉曼光譜參考條件以下分析條件可供參考，采用其他條件應(yīng)驗(yàn)證其適用性：激光能量≥250mW，數(shù)據(jù)采集時(shí)間≥2s。7.2.2測(cè)定在樣品池中依次加入200μL樣品待測(cè)液，50μL鹽酸溶液（1mol/L50μL碘化鉀溶液（1mol/L）混勻，再加入10μL表面增強(qiáng)試劑納米銀濃縮液，混勻后放入儀器檢測(cè)（檢測(cè)需在增強(qiáng)試劑加入后2min7.3質(zhì)控實(shí)驗(yàn)每批樣品應(yīng)做平行試驗(yàn)并同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)和加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)。7.3.1平行試驗(yàn)按樣品前處理（7.1）和樣品測(cè)定（7.2）步驟對(duì)同一試樣進(jìn)行平行試驗(yàn)測(cè)定。7.3.2空白實(shí)驗(yàn)用經(jīng)確證的陰性樣品，其余均按樣品制備步驟（7.1和7.2）進(jìn)行。7.3.3加標(biāo)質(zhì)控實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確稱取空白試樣2g置于樣品管中，加入適量標(biāo)準(zhǔn)工作液（100ng/mL），使恩諾沙星和環(huán)丙沙星濃度為10μg/kg，按照7.1和7.2步驟與樣品同法操作。8結(jié)果判定將測(cè)試結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫(kù)中的恩諾沙星(或環(huán)丙沙星)進(jìn)行比對(duì)，當(dāng)拉曼譜圖中出現(xiàn)恩諾沙星（或環(huán)丙沙星）的特征峰532cm-1、552cm-1、651cm-1、737cm-1和785cm-1(±6cm-1）五個(gè)特征峰出現(xiàn)四個(gè)或以上時(shí)，可定性判斷樣品為陽(yáng)性，否則為陰性。陰性代表該樣品不含恩諾沙星(或環(huán)丙沙星)或含量低于檢出限，陽(yáng)性則代表該樣品含有恩諾沙星(或環(huán)丙沙星)。水產(chǎn)品中恩諾沙星和環(huán)丙沙星表面增強(qiáng)拉曼光譜譜圖參見附錄A。9性能指標(biāo)9.1檢測(cè)限：恩諾沙星、環(huán)丙沙星均為10μg/kg。9.2靈敏度：靈敏度應(yīng)≥99%。9.3特異性：特異性應(yīng)≥85%。9.4假陰性率：假陰性率應(yīng)≤1%。9.5假陽(yáng)性率：假陽(yáng)性率應(yīng)≤15%。本方法為初篩方法，當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，應(yīng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行確證。4T/FJBR000-2021（資料性）光譜圖示例光譜圖示例參見圖A.1~圖A.2。圖A.1恩諾沙星(或環(huán)丙沙星)標(biāo)準(zhǔn)溶液的表面增強(qiáng)拉曼光譜譜圖（1000μg/kg）圖A.2水產(chǎn)品中恩諾沙星或環(huán)丙沙星表面增強(qiáng)拉曼光譜譜圖T/FJBR000-2021（資料性）性能指標(biāo)計(jì)算方法性能計(jì)算方法見表B.1。表B.1性能指標(biāo)計(jì)算方法樣品情況a檢測(cè)結(jié)果b總數(shù)N11N12N1.=N11+N12N21N22N2.=N21+N22總數(shù)N.1=N11+N12N.2=N21+N22N=N1.+N2.或N.1+N.2顯著性差異(х2)x2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21),自由度（df）=1靈敏度（p+，%）p+=N11/N1.特異性（p-，%）p-=N22/N2.假陰性率（pf-，%）pf-=N12/N1.=100-靈敏度假陽(yáng)性率（pf+，%）pf+=N21/N2.=100-特異性相對(duì)準(zhǔn)確度，%c（N11+N22）/(N1.+N2.)注：a由參比方法檢