3.1 重組DNA技術(shù)的基本工具課件-高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

第3章第1節(jié)人教版選擇性必修3（第二課時）三基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運輸車”

游離的DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞，一般會直接被分解，就算可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄并翻譯成蛋白質(zhì)、游離的DNA片段也無法隨著細(xì)胞分裂而進(jìn)行復(fù)制，導(dǎo)致子代細(xì)胞中不再含有目的基因。

若將目的基因插入載體，由于載體可以在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，隨著細(xì)胞分裂，載體會帶著目的基因存在于每個子代細(xì)胞中。這樣，基因工程才有意義。將外源基因?qū)爰?xì)胞，通常是利用質(zhì)粒作為載體。為什么不能直接將外源基因送入細(xì)胞呢？三基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運輸車”1.作用：將目的基因轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。2.種類：通常是用質(zhì)粒、噬菌體、動植物病毒也可以。①質(zhì)粒：一種常用載體，大多數(shù)質(zhì)粒的受體細(xì)胞是細(xì)菌。②噬菌體：受體細(xì)胞是細(xì)菌。③動植物病毒：受體細(xì)胞是動植物細(xì)胞。擬核DNA質(zhì)粒大腸桿菌細(xì)胞目的基因插入位點復(fù)制原點氨芐青霉素抗性基因大腸桿菌及質(zhì)粒結(jié)構(gòu)模式圖

質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。注意：它們的來源不同，在大小、結(jié)構(gòu)、復(fù)制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差別。三基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運輸車”3.運載體需具備的條件：①有一個至多個限制酶切點（便于插入目的基因）②能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存（自我復(fù)制或者插入到受體DNA同步復(fù)制）④有某些特殊的標(biāo)記基因（便于鑒定、篩選篩含有重組DNA分子的細(xì)胞）標(biāo)記基因通常有：①抗生素的抗性基因，如：抗氨芐青霉素基因(ampr)、抗四環(huán)素基因(tetr)。②熒光蛋白基因，如：綠色熒光蛋白基因(GFP)、紅色熒光蛋白基因(RFP)。③對受體細(xì)胞無害，不會影響受體細(xì)胞正常的生命活動真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過人工改造的。三基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運輸車”標(biāo)記基因的篩選原理資料卡

載體上的標(biāo)記基因一般是某種抗生素的抗性基因，而受體細(xì)胞沒有抵抗該抗生素的能力。將含有某抗生素抗性基因的載體導(dǎo)入受體細(xì)胞，抗性基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，受體細(xì)胞對該抗生素產(chǎn)生抗性。在含有該抗生素的培養(yǎng)基上，能夠生存的是被導(dǎo)入了載體的受體細(xì)胞。如圖所示：導(dǎo)入受體細(xì)胞培養(yǎng)加入氨芐青霉素只有含有載體，并且載體上的抗性基因表達(dá)的大腸桿菌才能存活并增殖含有氨芐青霉素抗性基因載體（如質(zhì)粒）1.若用家蠶作為某基因表達(dá)載體的受體細(xì)胞，在噬菌體和昆蟲病毒兩種載體中，不選用

作為載體，其原因是？噬菌體噬菌體的宿主細(xì)胞是細(xì)菌，而不是家蠶。病毒對宿主細(xì)胞的侵染具有一定的物種（組織）特異性。分析載體的種類和載體需具備的條件2．根據(jù)標(biāo)記基因的作用，有同學(xué)認(rèn)為在含有某種抗生素的培養(yǎng)基中篩選存活的受體細(xì)胞不一定是導(dǎo)入目的基因的受體細(xì)胞，這種說法是否合理？請解釋。合理，因為僅導(dǎo)入載體的和導(dǎo)入插入了目的基因的載體的受體細(xì)胞均能在該培養(yǎng)基中存活。合作探究：三基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運輸車”請你根據(jù)圖3-3中的相關(guān)信息找到兩條片段上EcoRI

的識別序列和切割位點。然后，用剪刀進(jìn)行“切割”。待切割位點全部切開后，將從下面那條DNA鏈上切下的片段重組到上面那條DNA鏈的切口處，并用透明膠條將切口粘連起來?！璗ATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG……TCCTAG…AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGAATTCCATAC…

GGTATG…GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG三基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運輸車”合作探究：(在G與A之間切割)EcoRI

限制酶識別序列：GAATTC1.剪刀和透明膠條分別代表哪種“分子工具”？

剪刀代表限制酶；透明膠條代表DNA連接酶。如果制作的黏性末端的堿基不能互補(bǔ)配對，可能是剪切位點或連接位點選得不對，也可能是其他原因。

不能，因為基因的長度一般在100個堿基對以上。2.你制作的黏性末端的堿基能不能互補(bǔ)配對？如果不能，可能是什么原因造成的？3.你插入的DNA片段能稱得上一個基因嗎？…TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG…GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG三基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運輸車”思考·討論：重組DNA技術(shù)中限制酶的選擇三基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運輸車”單酶切法：獲取目的基因和切割載體時，我們通常用同種限制酶，目的是為了獲得相同的黏性末端，便于目的基因與載體連接。使用單酶切法的缺點是：①目的基因環(huán)化

②載體環(huán)化

③目的基因和質(zhì)粒反向連接環(huán)化目的基因環(huán)化質(zhì)粒環(huán)化目的基因與質(zhì)粒連接目的基因11’載體22’1正向連接22’1’1’22’1反向連接思考·討論：重組DNA技術(shù)中限制酶的選擇三基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運輸車”為了避免上述情況發(fā)生，

可采取的措施是：

。分別使用兩種限制酶去切割目的基因和載體選擇限制酶的注意事項：1、選目的基因兩端和運載體都有的酶切位點；2、所選酶切位點不能破壞目的基因以及標(biāo)記基因。下列操作中選用哪種限制酶切割來構(gòu)建重組質(zhì)粒？圖1圖2BamHI

和

HindIII1.DNA連接酶是重組DNA技術(shù)中常用的一種工具酶。下列相關(guān)敘述正確的是A.能連接DNA分子雙鏈堿基對之間的氫鍵B.能將單個脫氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯鍵C.能連接用同種限制酶切開的兩條DNA片段，重新形成磷酸二酯鍵D.DNA連接酶只能連接雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端√2.關(guān)于基因運輸工具—載體，必須具備的條件之一及理由均正確的是（）A.能夠復(fù)制，以便目的基因插入其中B.具有多個限制酶切割位點，便于目的基因的表達(dá)C.具有某些標(biāo)記基因，便于重組DNA的篩選D.對受體細(xì)胞無害，便于重組DNA的篩選√考點突破3.某細(xì)菌質(zhì)粒上有標(biāo)記基因如圖所示，通過標(biāo)記基因可以推知外源基因(目的基因)是否轉(zhuǎn)入成功。外源基因插入的位置不同，細(xì)菌在培養(yǎng)基上的生長情況也不同，如圖所示是外源基因插入位置(插入點有a、b、c)示意圖，請根據(jù)表中提供的細(xì)菌生長情況，推測①②③三種重組后細(xì)菌的外源基因插入點，正確的一組是（

）插入點細(xì)菌在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上的生長狀況細(xì)菌在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上的生長狀況①能生長能生長②能生長不能生長③不能生長能生長A.①是c；②是b；③是aB.①是a和b；②是a；③是bC.①是a和b；②是b；③是aD.①是c；②是a；③是b√考點突破4.圖甲是含有目的基因的外源DNA片段，圖乙是用于將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的質(zhì)粒（陰影部分表示抗生素抗性基因），相關(guān)限制酶的作用部位如圖所示，現(xiàn)欲培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因抗病植株，回答下列問題。（1）在基因工程的操作中，不宜選用SmaI，原因是SmaI會破壞__________和__________________________。（2）在基因工程的操作中，宜選用限制酶____________。目的基因質(zhì)粒上的抗生素抗性基因PstI考點突破（3）由于反應(yīng)體系中含有大量的外源DNA片段和質(zhì)粒，加入PstI一種限制酶后，會得到大量的目的基因片段和質(zhì)粒片段，再加入DNA連接酶后，除了會形成目的基因與質(zhì)粒連接的環(huán)狀產(chǎn)物外，還會形成______________________連接的環(huán)狀產(chǎn)物以及_____________________連接的環(huán)狀產(chǎn)物。質(zhì)粒片段與質(zhì)粒片段目的基因與目的基因限制酶DNA連接酶載體①對受體細(xì)胞無害；②有一個至多個限制酶切割位點；③有特殊的標(biāo)記基因；④能自我復(fù)制或能整合到宿主DNA上。質(zhì)粒、噬菌體、動植物病毒基因工程的基本工具作為載體的條件種類：磷酸二酯鍵來源：主要來源于原核生物特點：作用部位：具有專一性結(jié)果：形成黏性末端或平末端連接部位：磷酸二酯鍵種類：E.coliDNA連接酶、T4DNA連接酶作用：把兩條雙鏈DNA片段拼接起來

課堂小結(jié)四DNA的粗提取與鑒定1.實驗原理：（1）提取DNA的原理：DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面存在差異，可以利用這些差異，選用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)方法對它們進(jìn)行提取。DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精初步分離DNA和蛋白質(zhì)DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L的NaCl溶液溶解DNA（2）鑒定DNA的原理：在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑會呈現(xiàn)藍(lán)色。通過反復(fù)溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì)。

四DNA的粗提取與鑒定2.材料用具：（1）實驗材料的選擇：DNA含量相對較高的生物組織，如新鮮洋蔥、香蕉、菠菜、菜花和豬肝等。你認(rèn)為如下提供的材料中是否都適合提取DNA？為什么？洋蔥香蕉豬肝菠菜豬血（注意：不能選擇哺乳動物成熟的紅細(xì)胞，因為哺乳動物成熟的紅細(xì)胞中

沒有細(xì)胞核和線粒體，幾乎不含DNA。）?四DNA的粗提取與鑒定2.材料用具：（2）試劑及用具選擇：試劑：研磨液、體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精、2mol/L的NaCl溶液、二苯胺試劑和蒸餾水等。用具：燒杯、量筒、玻璃棒、研缽、紗布、漏斗、試管、試管架、試管夾、酒精燈、石棉網(wǎng)、三腳架、火柴、刀片和天平等。①研磨液②體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精③2mol/L的NaCl溶液④二苯胺試劑析出DNA溶解DNA鑒定DNA破壞細(xì)胞，釋放出細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)，維持DNA穩(wěn)定，提高DNA溶解度。研磨液成分作用Tris-HCl緩沖液穩(wěn)定DNAEDTA抑制DNA酶SDS使蛋白質(zhì)變性《教材》P117——附錄2四DNA的粗提取與鑒定3.實驗步驟：稱取30g洋蔥，切碎，然后放入研缽中，倒入10mL研磨液，充分研磨。研磨洋蔥取材、研磨研磨目的：破碎細(xì)胞，使核物質(zhì)容易溶解在研磨液中。注意：①研磨時間不宜太長，防止研磨時產(chǎn)生的熱量影響DNA的提取量。②可在研磨液中加入纖維素酶、果膠酶，有利于充分研磨。四DNA的粗提取與鑒定3.實驗步驟：取材、研磨過濾或離心方法一：在漏斗中墊上紗布，將洋蔥研磨液過濾到燒杯中，在4℃冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液。方法二：直接將研磨液倒入塑料離心管中，1500r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min，再取上清液放入燒杯中。思考：①上清液中除DNA之外，可能含有哪些雜質(zhì)？

可能含有核蛋白、多糖等雜質(zhì)②低溫放置幾分鐘有什么作用？

抑制核酸水解酶的活性，進(jìn)而抑制DNA降解；

抑制DNA分子運動，使DNA易形成沉淀析出。DNA會被吸附到濾紙上而大量損失，影響最終提取的DNA量。四DNA的粗提取與鑒定3.實驗步驟：方法一：在上清液中加入體積相等的、預(yù)冷的酒精溶液（體積分?jǐn)?shù)為95%），靜置2-3min，溶液中出現(xiàn)的白色絲狀物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去上面的水分；用冷卻的酒精析出DNA取材、研磨過濾或離心分離思考：①攪拌時應(yīng)輕緩、并沿一個方向？

減少DNA斷裂，以便獲得較完整的DNA分子②酒精預(yù)冷的作用？低溫可抑制核酸水解酶的活性，進(jìn)而抑制DNA降解；低溫抑制DNA分子運動，使DNA易形成沉淀析出；低溫有利于增加DNA的柔韌性，減少斷裂。方法二：將溶液倒入塑料離心管中，在10000r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min，棄上清液，將管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。四DNA的粗提取與鑒定3.實驗步驟：取材、研磨過濾或離心分離鑒定取兩支20mL的試管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。將絲狀物或沉淀物溶于其中一支試管的NaCl溶液中。向兩支試管中各加入4mL的二苯胺試劑。混合均勻后，將試管置于沸水中加熱5min。待試管冷卻后，比較兩支試管中溶液顏色的變化。鑒定DNA鑒定結(jié)果對照組實驗組溶液藍(lán)色的深淺與溶液中DNA的含量的多少有關(guān)。二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用，用棕色瓶保存。1.利用新鮮洋蔥作為實驗材料提取DNA時,說法正確的是（）A.可將洋蔥置于清水中，細(xì)胞吸水破裂后將DNA釋放出來B.離心后上清液中加入7