靈芝及相關(guān)產(chǎn)品多糖的提取與測(cè)定技術(shù)規(guī)程

I靈芝及相關(guān)產(chǎn)品多糖的提取與測(cè)定技術(shù)規(guī)程范圍本文件界定了靈芝及相關(guān)產(chǎn)品多糖提取與測(cè)定的術(shù)語(yǔ)和定義、規(guī)定了使用的儀器和試劑、提取與測(cè)定步驟。本文件適用于靈芝子實(shí)體及其制品切片、孢子粉（破壁孢子粉）中靈芝多糖的提取及測(cè)定。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB5749生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T31640食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食用酒精GB/T603化學(xué)試劑試驗(yàn)方法中所用制劑及制品的制備N(xiāo)Y/T11676食用菌中粗多糖含量的測(cè)定GB/T32198紅外光譜定量分析技術(shù)通則術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1多糖多糖是一類(lèi)由10個(gè)以上單糖通過(guò)糖苷鍵連接而成的高分子化合物，能被水解為單糖。儀器和試劑4.1儀器分析天平：感量0.01g和0.0001g，粉碎機(jī)，0.425mm標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)篩，恒溫水浴鍋，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，離心機(jī)，真空冷凍干燥機(jī)，紫外分光光度計(jì)，紅外光譜儀，高效液相色譜儀。4.2試劑單糖標(biāo)準(zhǔn)品（葡萄糖、半乳糖、甘露糖、核糖、木糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、鼠李糖、阿拉伯糖、巖藻糖）：純度≥97%，甲醇：色譜純，乙腈：色譜純，三氟乙酸，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP），氯仿，二水合磷酸二氫鈉，十二水合磷酸氫二鈉，氯化鈉，氫氧化鈉，苯酚：重蒸餾，硫酸：ρ=1.84g/mL，鹽酸，95%食用酒精，溴化鉀。提取與測(cè)定步驟5.1多糖提取5.1.1原料預(yù)處理取靈芝子實(shí)體或靈芝切片，粉碎機(jī)粉碎（靈芝孢子粉無(wú)需粉碎），過(guò)0.425mm標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)篩，將樣品裝于密封容器中，標(biāo)明標(biāo)記，備用。5.1.2多糖提取取一定量靈芝粉末，按照料液比1:40（mg/mL），100℃水浴提取3h，離心或過(guò)濾，取濾液；濾渣加40倍水，100℃水浴再次提取3h，離心或過(guò)濾，取濾液。合并兩次提取濾液，減壓濃縮至總濾液體積的1/3，得濃縮液，攪拌加入95%食用酒精至酒精濃度75%，4℃~10℃醇沉12h以上。離心收集沉淀物，真空冷凍干燥后得到靈芝多糖。5.2多糖含量測(cè)定檢測(cè)提取所得多糖含量。精密稱(chēng)取干燥的靈芝多糖適量溶解，按NY/T1676中規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定。5.3紅外光譜掃描檢測(cè)多糖特征結(jié)構(gòu)基團(tuán)。取干燥的靈芝多糖1mg~2mg與100mg左右干燥溴化鉀粉末混合，置于石英研缽中研磨成細(xì)小粉末，壓片，紅外光譜儀對(duì)樣品進(jìn)行掃描，按GB/T32198中規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定。5.4分子量測(cè)定5.4.1色譜條件色譜柱：ShodexOHpakSB-804HQ；流動(dòng)相：0.1mol/L氯化鈉溶液；柱溫：35℃；流速：0.5mL/min；進(jìn)樣量：20μL；檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器。5.4.2測(cè)定精密稱(chēng)取適量靈芝多糖，0.1mol/L氯化鈉溶液溶解得到2mg/mL的待測(cè)樣，按5.4.1所述條件進(jìn)樣，使用GPC分析軟件計(jì)算樣品分子量。5.5單糖組成測(cè)定5.5.1色譜條件色譜柱：C18柱，長(zhǎng)250mm，內(nèi)徑4.6mm，粒度5μm；流動(dòng)相：pH6.7磷酸鹽緩沖液：乙腈=83：17（體積比v/v），等度洗脫；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：245nm；流速：1mL/min；進(jìn)樣體積：20μL；檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器。5.5.2單糖衍生精密稱(chēng)取干燥的靈芝多糖1mg于水解管中，加入4mol/L三氟乙酸溶液200μL，120℃水解2h，冷卻至室溫后，加入甲醇在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上多次旋蒸去除三氟乙酸。加入100μL水溶解，待衍生化。往水解液中加入0.6mol/L氫氧化鈉溶液100μL，混勻，加入200μL的PMP甲醇溶液，混勻，70℃反應(yīng)100min。冷卻至室溫，加入100μL0.3mol/L鹽酸溶液，混勻，轉(zhuǎn)移至離心管中，加入水1.5mL，氯仿2mL，渦旋混勻后靜置，取上層溶液再加