組培室學(xué)員培訓(xùn)操作規(guī)程

組培室組培技術(shù)操作規(guī)程

一、植物組織培養(yǎng)概論及其技術(shù)原理

組培室的定位：以引進(jìn)、開發(fā)為基礎(chǔ)，組培技術(shù)為手段,自主研發(fā)為突破，實(shí)現(xiàn)

潛力品種的快速繁育和工廠化生產(chǎn)、新品種選育、種質(zhì)資源保存。

植物組織培養(yǎng)概念：又叫離體培養(yǎng)，是把植物離體的器官、組織或細(xì)胞，在營(yíng)養(yǎng)

基質(zhì)上進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)的一種方法，用控制培養(yǎng)基成分及其他環(huán)境因素的方法，使

培養(yǎng)材料定向的生長(zhǎng)、分化與發(fā)育形成完整植株的過(guò)程C是植物無(wú)性繁殖的一種。

原理：植物細(xì)胞的全能性（植物的每個(gè)細(xì)胞都含有該物種的全部遺傳信息，從而

具備發(fā)育成完整植株的遺傳能力，原因是植物的所有細(xì)胞都是受精卵通過(guò)有絲分

裂產(chǎn)生的，具有和受精卵一樣的DNA序列和細(xì)胞質(zhì)環(huán)境，只是受所在器官和組

織的束縛，只能部分表達(dá)，一旦離體，在一定的營(yíng)養(yǎng)條件和激素誘導(dǎo)下即可表達(dá)

其全能性。）

流程：生產(chǎn)方案制定、培養(yǎng)基制備、初代培養(yǎng)（啟動(dòng)培養(yǎng)、誘導(dǎo)培養(yǎng)X繼代培

養(yǎng)（增殖培養(yǎng)\生根培養(yǎng)、煉苗移植、定植或銷售。

分類：液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)（植株培養(yǎng)、胚胎培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)、原生

質(zhì)體培養(yǎng)\

應(yīng)用：種苗快速繁殖；苗木脫毒；新品種培育（胚胎培養(yǎng)，原生質(zhì)體融合）；保

存植物種植資源；生產(chǎn)植物性藥品和生物制品（利用組織或單細(xì)胞的大量培養(yǎng),

提取蛋白質(zhì)，香料、生物堿等化合物）

組織培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：培養(yǎng)材料經(jīng)濟(jì)；繁殖速度快、繁殖系數(shù)大；后代整齊劃一，干

形優(yōu)良；能保持母本的優(yōu)良性狀；可獲得無(wú)毒苗；管理方便、可工廠化生產(chǎn)

二、組培室藥品及主要儀器設(shè)備的安全使用

藥品日常管理：

1、安排專人保管，做好藥品進(jìn)出臺(tái)賬，杜絕過(guò)期藥品入庫(kù)。

2、保持藥品儲(chǔ)藏條件。

3、確保藥品的質(zhì)量安全，藥品按規(guī)定的儲(chǔ)存要求存放,

4、對(duì)庫(kù)存藥品進(jìn)行定期的質(zhì)量檢查，并做好檢查記錄。發(fā)現(xiàn)有質(zhì)量問(wèn)題，應(yīng)立

即停止使用，并第一時(shí)間通知部門負(fù)責(zé)人；

5、按規(guī)定建立藥品出庫(kù)記錄，對(duì)近期無(wú)法使用的藥品和過(guò)期藥品應(yīng)及時(shí)上報(bào)，

做到"無(wú)差錯(cuò)，無(wú)丟失，無(wú)變質(zhì)"；

6、藥品使用人員應(yīng)具備相應(yīng)的藥品安全知識(shí)、使用規(guī)范及稱量規(guī)范；

7、藥品使用完畢后，使用人應(yīng)將剩余藥品放回。

藥品使用注意事項(xiàng)：

1、配藥時(shí)配藥人員要戴膠皮手套，稱量時(shí)按照配方準(zhǔn)確稱量。

2、藥品不得用手觸碰，不得用嘴嘗試，稱量后藥匙所剩藥品不得放回原藥瓶。

3、用藥工作結(jié)束后，將藥品放回原處，所用工具清洗干凈并用純水潤(rùn)洗三遍。

應(yīng)急處理：

1、皮膚接觸藥品：立即脫去污染的衣著，用大量流動(dòng)清水沖洗；若感不適立即

就醫(yī)。

2、眼睛接觸藥品：立即提起眼瞼，用大量流動(dòng)清水或生理鹽水徹底沖洗至少15

分鐘；若感不適立即就醫(yī)。

3、吸入藥品：迅速脫離現(xiàn)場(chǎng)至空氣新鮮處，保持呼吸道通暢；如呼吸困難，立

即進(jìn)行心臟胸外擠壓術(shù)（嚴(yán)謹(jǐn)進(jìn)行口對(duì)口式人工呼吸X

4、食入藥品：立即給飲植物油15~30mL,催吐,并立即送往醫(yī)院救治。

5、各部門制定完善的應(yīng)急救援預(yù)案，并組織反事故演練，充分做好各項(xiàng)應(yīng)急準(zhǔn)

備工作，降低事故造成的人身傷害。

常用儀器設(shè)備安全操作

壓力蒸汽滅菌器

1、滅菌液體時(shí)，應(yīng)將液體罐裝在硬質(zhì)的耐熱玻璃瓶中，以不超過(guò)3/4體積為好。

須待壓力表指針回復(fù)到零位后方可打開。

2、對(duì)不同類型，不同滅菌要求的物品，如輔料和液體等,切勿放在一起滅菌，

以免顧此失彼，造成損失。

3、取放物品時(shí)注意不要被蒸氣燙傷，可戴上線手套。

4、在日常使用過(guò)程中如發(fā)現(xiàn)螺絲、螺母松動(dòng)現(xiàn)象，應(yīng)及時(shí)加以緊固，確保正常

使用。

5、平時(shí)應(yīng)用潔布擦拭設(shè)備，保證設(shè)備的清潔和干燥,以延長(zhǎng)使用年限。

6、一旦發(fā)現(xiàn)問(wèn)題，立即切斷電源，聯(lián)系專業(yè)人事維修,

電子天平使用注意事項(xiàng)

1、將天平置于穩(wěn)定的工作臺(tái)上避免振動(dòng)、氣流及陽(yáng)光照射。

2、在使用前調(diào)整水平儀氣泡至中間位置。

3、電子天平應(yīng)按說(shuō)明書的要求進(jìn)行預(yù)熱。

4、稱量易揮發(fā)和具白腐蝕性的物品時(shí)，要盛放在密閉的容器中，以免腐蝕和損

壞電子天平。

5、經(jīng)常對(duì)電子天平進(jìn)行自?；蚨ㄆ谕庑?，保證其處于最佳狀態(tài)。

6、如果電子天平出現(xiàn)故障應(yīng)及時(shí)檢修，不可帶"病"工作。

7、操作天平不可過(guò)載使用以免損壞天平。

臭氧發(fā)生器

臭氧發(fā)生器是一種釋放臭氧離子，通過(guò)釋放的臭氧離子可以損傷病菌或病毒的蛋

白質(zhì)和酶分子，從而導(dǎo)致其功能改變。因此，臭氧與生物物質(zhì)的作用是通過(guò)DNA

分子直接吸收導(dǎo)致的DNA損傷的作用，以及被某些色素吸收導(dǎo)致活性氧產(chǎn)生，

與周圍DNA、蛋白質(zhì)、酶、細(xì)胞膜等生物分子反應(yīng)的間接作用進(jìn)行的。臭氧不

僅對(duì)微生物有致命的影響,臭氧對(duì)眼、鼻、喉有刺激的感覺(jué)，濃度高時(shí)，會(huì)出現(xiàn)

頭疼等癥狀。

臭氧發(fā)生器的使用要嚴(yán)格按照儀器使用說(shuō)明書進(jìn)行使用，臭氧發(fā)生器的使用一般

是通過(guò)電子時(shí)控器進(jìn)行開關(guān)的控制，在臭氧發(fā)生器開啟的時(shí)段內(nèi)，要確保無(wú)人員

的出入，且門窗關(guān)閉，以達(dá)到較好的滅菌消毒效果。臭氧發(fā)生器停止工作后，人

員不可立即進(jìn)入培養(yǎng)室，一般2-3小時(shí)后方可進(jìn)入，原則上是進(jìn)入培養(yǎng)室內(nèi)的人

員問(wèn)不到臭氧的味道為準(zhǔn)。

一旦發(fā)現(xiàn)有人頭暈?zāi)X脹，立刻空曠透氣的地方，情節(jié)嚴(yán)重者立即就醫(yī)。

紫外燈

紫外線不僅對(duì)微生物有致命影響，對(duì)人也有一定的致癌作用。因此，當(dāng)植物

組織培養(yǎng)或細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室在用紫外線消毒期間，工作人員不要處在正消毒的空

間內(nèi)，更不要用眼睛注視紫外燈，也要避免手長(zhǎng)時(shí)間在開著紫外燈的超凈工作臺(tái)

內(nèi)進(jìn)行操作。一般在接種室用紫外線消毒后，不要立即進(jìn)入接種室，此時(shí)室內(nèi)充

滿高濃度的臭氧，會(huì)對(duì)人體，尤其是呼吸系統(tǒng)造成傷害。應(yīng)在關(guān)閉紫外線燈15~

20分鐘后再進(jìn)入室內(nèi)。

酒精的安全使用

組培室內(nèi)使用的酒精濃度分為95%和75%。，酒精燈的酒精濃度為95%,對(duì)手、

臂消毒的酒精濃度為75%,在使用過(guò)程中,我們都進(jìn)行嚴(yán)格的標(biāo)記，看好標(biāo)記

再進(jìn)行使用，千萬(wàn)不可混用。

組培室內(nèi)應(yīng)備用滅火器，并及時(shí)檢查。（一般用干粉滅火器，切記不可使用泡沫

滅火器），也可用細(xì)砂，濕抹布，用于隔斷氧氣。

三、常用培養(yǎng)基和激素的種類及特點(diǎn)

常用培養(yǎng)基種類及特點(diǎn)

基本培養(yǎng)基名稱

培養(yǎng)基特點(diǎn)主要適用范圍

無(wú)機(jī)鹽和離子濃度較高.為較穩(wěn)定的廣泛用于植物的器官、花

MS平衡溶液。其中鉀鹽、餞鹽和硝酸鹽含量藥、細(xì)胞和原牛質(zhì)體培養(yǎng)

較高

含有較高鉀鹽和鹽酸硫胺素.但鐵鹽南洋杉、第葡等木本植物

Bs含證低.這可能對(duì)有些培養(yǎng)物生長(zhǎng)有抑制及豆科、十字花科植物的培養(yǎng)

作用

無(wú)機(jī)鹽含垃較低，但提高了MgSO,生根培養(yǎng)

White

的濃度和增加了硼索

成分較簡(jiǎn)單但KNO,和（NH,LSO,小麥、水帶及其他植物的

N1?

含量高花藥培養(yǎng)等

有機(jī)成分較復(fù)雜,包括所有的單鐐和禾谷類和豆科植物的原

KM-8P

維生素生質(zhì)鑒合的培養(yǎng)

WPM硝態(tài)氮和Ca、K含量高?不含碘和性木本植物的莖尖培養(yǎng)

化合物名稱培才睫乂

MSFhitc一*

VPM-N”KnudsonC

ZnSO??7HjO8.6

328.67.5-7o

CoCi,?6H：O0.0250.025

0.025

CuSO<,5H|O0.0250.030.0250.025

MoO?

0.25

Na:MoO??2H.O0.250.25

KI0.830.750.750.810

H.BO,6.21.536.21.6

NaH.PO.-HtO16.5150

維生拿PP)0.5,0.510.50.5

款?時(shí)哆，0.50.110.50.5

10.10.1100.51

I機(jī),100100100100

甘氣.2322

5.8工〃6.0

Ut!______5.85.65.55.8

常用激素種類及特點(diǎn)

生長(zhǎng)素類：促進(jìn)生長(zhǎng)。IAA活性相對(duì)較弱，對(duì)器官形成的副作用較小，高溫高壓、

見光易分解，也容易被植物體內(nèi)的叫I。朵乙酸氧化酶分解氧化。NAA匕盛穩(wěn)定,

比IAA活性強(qiáng)，應(yīng)用較廣泛（一定濃度下促進(jìn)葉生長(zhǎng)較好\IBA誘導(dǎo)生根能力

較強(qiáng)。2,4-0（2,4-二氯苯氧乙酸）啟動(dòng)能力很高，促進(jìn)愈傷形成活力強(qiáng)，會(huì)抑

制側(cè)芽生長(zhǎng)。

活性：2,4-D>NAA>IBA>IAA

細(xì)胞分裂素：促進(jìn)細(xì)胞分裂，促進(jìn)側(cè)芽生長(zhǎng)，抑制根的形成，打破頂端優(yōu)勢(shì)。

活性：TDZ（―苯?。?gt;CPPU（毗效隆、KT-30）>ZT>2?ip（2-異戊烯腺

瞟吟）〉6-BA（6-采基腺喋吟）>KT（激動(dòng)素）

赤霉素：主要用于幼苗莖的伸長(zhǎng)生長(zhǎng),還可以打破休眠，主要在壯苗期使用。

激素使用的量不是絕對(duì)值而是相對(duì)值，不同植物使用量不同，同種植物不同階

段、不同周期的使用量也不盡相同。

四、母液及培養(yǎng)基的配制

母液配制及注意事項(xiàng)

母液分為：大量、微量、有機(jī)、鐵鹽

大量：一般大量和鈣離子化合物，一般分開配制，以防產(chǎn)生硫酸鈣、磷酸鈣沉淀

（MS大量配制可分開溶解，后將鈣離子化合物緩慢倒入其他大量中，然后定容

至指定量X大量藥品較多，T殳母液倍數(shù)較小。

微量：微量不易溶解，可單一溶解，后混合定容。

有機(jī)：糖、維生素、肌醇、氨基酸、腺瞟吟、天然復(fù)合物等。有機(jī)物容易產(chǎn)生絮

狀物（實(shí)則為霉菌I

鐵鹽：N32-EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）,FeSO4-7H2O分別溶解；Na2-EDTA電

爐加熱至微沸，將FeSO4-7H2O緩慢倒入，邊倒邊攪拌，加熱至金黃色，調(diào)節(jié)

PH5.5。

激素的配制：可以根據(jù)常用濃度來(lái)選擇配制濃度，方便移取。一般的激素可用乙

醇溶解，或者用氫氧化鈉、鹽酸。

母液配置完成后，標(biāo)記配制倍數(shù)或濃度、詳細(xì)日期，每升培養(yǎng)基所取量，放入

2-4度冰箱保存，如發(fā)現(xiàn)絮狀物或結(jié)晶沉淀則不可再用。

培養(yǎng)基的配制

注意事項(xiàng)：配制培養(yǎng)基之前檢查母液是否有絮狀物或沉淀產(chǎn)生；培養(yǎng)基配制T殳

使用純水；加入糖時(shí)一定要不停的攪拌；如果需要加入活性炭，需在調(diào)節(jié)PH之

前加。

五、無(wú)菌操作流程及注意事項(xiàng)

接種室外準(zhǔn)備工作

1、換上拖鞋,將自己的鞋整齊的擺放的鞋架上。

2、進(jìn)入更衣室,穿上無(wú)塵服，將無(wú)菌操作服衣袖卷至手臂，切記自己的衣袖不

可露于無(wú)菌操作服衣袖的外面。將頭發(fā)全部挽入操作帽內(nèi)，防止頭皮屑掉落。

3、清洗手指、手臂。

4、潔凈室的每一道門都要保持關(guān)閉狀態(tài)，記住隨手關(guān)門。

接種室內(nèi)準(zhǔn)備工作

1、自動(dòng)控制器需在工作前20分鐘打開無(wú)菌操作臺(tái)的風(fēng)、燈開關(guān)暖機(jī)（注意：

發(fā)出藍(lán)紫色光的為紫外線殺菌燈，長(zhǎng)時(shí)間照射眼睛會(huì)刺痛\

2、將垃圾筐內(nèi)套上垃圾袋。

3、將無(wú)菌操作臺(tái)按照從上到下順序用75%的酒精擦干凈

4、用小臺(tái)車將當(dāng)天所需的組培苗和培養(yǎng)基瓶一次性運(yùn)夠。請(qǐng)注意組培苗的每一

瓶代號(hào)要看清確定為自己所需，培養(yǎng)基代號(hào)要分清，不能100%確定的不能用

5、將當(dāng)天所用的工具（長(zhǎng)短銀子、剪刀、解剖刀、勺子、試管、廣口瓶等酒精、

紗布、口罩、油性筆等）準(zhǔn)備好。

消毒工作

1、手進(jìn)入操作臺(tái)前先用乃％的酒精將手、手臂消毒方可進(jìn)行下一步操作。

2、將操作臺(tái)里的消毒器、工具（銀子、剪刀、勺子），工具架，酒精燈等消毒全

面且擦拭干凈。銀子、刀柄、剪子等工具水平放置在操作臺(tái)最里面放置時(shí)切記

不可將高效濾網(wǎng)（網(wǎng)格后面折疊紙狀）扎破。

3、將已經(jīng)消毒好的工具（銀子，剪刀,解剖刀，勺子）插到消毒器的石英砂中。

（注意：盡量插深，以便工具能消毒徹底）

4、將消毒器開關(guān)打開，加熱燈亮，正常加熱，20-30分鐘后恒溫?zé)袅?說(shuō)明加

熱完畢，此時(shí)工具可以取出，放在工具架上冷卻，注意取工具時(shí)，將工具迅速?gòu)?/p>

石英砂中拔出，工具若碰到消毒器的任何部位必須重新將工具消毒，20-30秒

方可徹底消毒（注:工具在消毒器中時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)以免冷卻不徹底燙傷組培苗I

如果消毒器出現(xiàn)異常（如：恒溫?zé)粢恢辈涣恋?，及時(shí)反饋\

操作流程

1、操彳乍前檢查：仔細(xì)查看原組培苗的品號(hào)是否為自己所需，組培苗是否感染,

確定沒(méi)問(wèn)題后方可進(jìn)行下一步操作。如發(fā)現(xiàn)原瓶感染和異常情況要及時(shí)匯報(bào)，須

經(jīng)管理人員確認(rèn)后再做處理。

2、培養(yǎng)基原組培苗消毒：將未消毒的原組培苗和培養(yǎng)基瓶放置于操作臺(tái)最外面

以放5瓶為標(biāo)準(zhǔn)，如放太多會(huì)造成操作臺(tái)過(guò)度擁擠,易不慎感染。用75%的酒

精將培養(yǎng)基瓶和原組培苗瓶轉(zhuǎn)圈噴濕，用噴濕的紗布先擦培養(yǎng)基瓶，再擦原組培

苗瓶，要小心全面擦拭干凈，消毒徹底后放入操作臺(tái)最里面。

3、開培養(yǎng)皿：酒精消毒后將報(bào)紙打開，把培養(yǎng)皿推置操作臺(tái)最里側(cè)。（培養(yǎng)皿前

方不可有任何物品，確保風(fēng)可以吹過(guò)。）

4、開瓶：開瓶時(shí)先開原組培苗后開培養(yǎng)基。開原組培苗：火烤原組培苗（火烤

時(shí)間不可過(guò)長(zhǎng)，以免組培苗被燙傷），將擦過(guò)的原組培苗移至火焰上方，瓶口向

上傾斜45。均勻火烤2圈后，方可開瓶（火焰前方菌類存在的幾率?。?，開瓶后

快速火烤瓶口，將原組培苗的瓶塞放在操作臺(tái)外側(cè)然后用同樣的方法開培養(yǎng)基,

培養(yǎng)基的塞子迅速火烤后放在右側(cè)最里邊（塞子前方不能放任何物品X注意：

用手開瓶時(shí)，拇指切記不可接觸到瓶口?？酒靠跁r(shí)，要火烤均勻，不可局部加熱

（瓶子易炸裂），以均勻火烤轉(zhuǎn)2圈為宜；要在火焰前方開瓶。

5、移苗：從工具架上拿起鏡子,把銀子放入培養(yǎng)基瓶中冷卻（手不能揮過(guò)瓶口,

工具應(yīng)傾斜，銀尖應(yīng)中自然張開傾斜插入培養(yǎng)基免培養(yǎng)基被劃破X待工具冷卻

后開始進(jìn)行組培苗轉(zhuǎn)移工作，首先將苗子轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，移苗時(shí)所有動(dòng)作均應(yīng)

水平移動(dòng)，手與工具切記不可揮過(guò)瓶口及培養(yǎng)皿上方，往培養(yǎng)基皿中放苗時(shí)，工

具應(yīng)傾斜于培養(yǎng)皿上方可垂直（目的是防止攪動(dòng)操作臺(tái)內(nèi)水平吹出的空氣和

防止菌落掉入培養(yǎng)皿內(nèi)。

注意事項(xiàng)：（1）夾苗時(shí)不可從瓶口上方去看應(yīng)該透過(guò)瓶壁去看（2）夾苗時(shí)不

能夾傷葉片，要夾苗的基部或根部。

6、切苗：切苗時(shí)用銀子夾住苗的莖部，解刨刀豎著從苗基部交接處豎著切（目

的：1.防止組培苗出現(xiàn)褐化。2.控制產(chǎn)生不定芽。）切苗時(shí)工具應(yīng)傾斜于培養(yǎng)皿

的上方，不可垂直，（目的是防止攪動(dòng)操作臺(tái)內(nèi)水平吹出的空氣和防止菌落掉入

培養(yǎng)皿內(nèi)\將切好的苗子根據(jù)做苗根據(jù)要求，夾至培養(yǎng)基中，要注意分級(jí)，差

不多大小的苗放在同一培養(yǎng)基瓶中。按組培苗的不同類；不同階段的不同要求去

分級(jí)注意控制好苗的高度.切完一組培苗后將刀和銀子插入消毒器消毒20-30

秒。

7、插苗：從工具架上拿另一把已經(jīng)冷卻好的銀子開始插苗。插苗時(shí)要按不同苗

不同階段的不同要求來(lái)排列。苗不可多也不可少。插苗時(shí)根要插入培養(yǎng)基中，但

不可將組培苗葉心也淹沒(méi)在培養(yǎng)基中。中母瓶，子瓶組培苗要干凈整齊，不能帶

小芽且分級(jí)好、苗站的直、基部全都插入培養(yǎng)基中保證每株苗無(wú)變異、玻璃化、

黃葉、被工具扎傷，夾傷，燙傷等。母瓶組培苗要求連芽，干凈整齊，分級(jí)好、

苗站的直、根全部切干凈，（注意：子瓶中母組培苗要種的深，沒(méi)有發(fā)黃的底葉

一律不許切，母瓶要種的淺，切記葉心不能淹沒(méi)在培養(yǎng)基中I

8、工具再消毒及封瓶口：插完苗子之后，將工具工具重新放入消毒器中進(jìn)行消

毒，時(shí)間20-30秒，消毒完畢及時(shí)取出工具。在火焰前方蓋上瓶蓋并且擰緊瓶

口，放在小臺(tái)車上（封口時(shí)注意不要將火封進(jìn)瓶?jī)?nèi)造成組培苗黃化死亡I

9、每種完一瓶后，更換另一套工具，再繼續(xù)下一瓶的操作。

結(jié)束工作

1、將當(dāng)天種好的組培苗寫上培養(yǎng)基代號(hào)、品種代號(hào)、操作員代號(hào)與日期，擺

到小臺(tái)車上面。

2、將用過(guò)的紗布、接種盤洗干凈，關(guān)上消毒器，操作臺(tái)等各開關(guān)。

3、將當(dāng)天移完的空瓶子、垃圾、用過(guò)的工具通過(guò)傳遞倉(cāng)拿出操作室放至洗刷

室。

4、將當(dāng)天種植完成的組培苗按要求整齊擺到培養(yǎng)室內(nèi)指定的架子上,當(dāng)天未

用完的培養(yǎng)基放回指定的位置,不可亂放。

5、檢直各儀器電源的關(guān)閉狀況

注意事項(xiàng)

1、所有培養(yǎng)皿、剪刀、銀子、刀柄都要先用NaOH泡7-10min,用純凈水沖

洗干凈，用報(bào)紙包好再進(jìn)行滅菌。

2、換品種時(shí)要重新擦操作臺(tái)換手套、工具。

3、將培養(yǎng)基瓶、原組培苗、托盤等整齊放在臺(tái)車上。

4、整個(gè)組培苗移植過(guò)程應(yīng)在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)完成，手、工具出操作臺(tái)之后，手須

用酒精消毒，工具須重新消毒。

5、遇到原組培苗感染且已開瓶，要封上所有瓶口重新徹底給操作臺(tái)及工具消毒。

6、遇有可懷疑現(xiàn)象（如培養(yǎng)基外觀和以往不同；組培苗品號(hào)不清或位數(shù)不對(duì)；

組培苗葉子上有感染跡象或小蟲，同一瓶?jī)?nèi)組培苗出現(xiàn)異常的）要及時(shí)匯報(bào)管理

人員，處理后再進(jìn)行操作。

7、酒精屬于易燃液體，在手上沾有酒精時(shí)不得靠近酒精燈。

8、打火機(jī)是易燃易爆物品要遠(yuǎn)離酒精燈，消毒器。

意外情況及應(yīng)急處理措施

1、燙傷、割傷組培室備有緊急藥箱，包括酒精棉、紗布、創(chuàng)可貼、外涂軟膏、

紅花油、董香正氣滴丸等，一旦發(fā)生意外可立即處理，情況嚴(yán)重者即可送往醫(yī)院。

2、酒精燈著火在超凈工作臺(tái)旁放置濕抹布，一旦發(fā)生立即撲滅。

六、外植體的選擇及無(wú)菌體系建立

外植體的選擇

外植體部位：莖段、種子、塊莖、葉片、根、胚珠、花藥等

取材季節(jié)：大部分植物選擇在其開始生長(zhǎng)的時(shí)期較好，一般三月、四月、五月較

好，污染率褐化均較少。

生理發(fā)育年齡：一般認(rèn)為幼嫩的組織具有較高的生態(tài)發(fā)生能力，對(duì)于木本而言，

越靠下部的主干萌生條，生理年齡越小，尤其根孽。

外植體大?。和庵搀w太小不易成活（脫毒需越小越好），太大不易消毒，一般在

0.5-lcm左右。

外植體消毒

一般取外植體后，剪成l-2cm,先用流水沖洗20min-2h,如不平滑或有毛被

則需用細(xì)毛刷輕輕刷去表面污垢后再流水沖洗，沖洗完成后進(jìn)行超凈工作臺(tái)內(nèi)的

消毒滅菌工作

常用消毒劑的使用和效果

消毒劑

使用濃度/%消除難易消毒時(shí)間/min滅菌效果

次氯酸鈉

2易5-30很好

次氨酸件

9-10易5-30很好

漂白粉

飽和溶液易5-30很好

升求

0.1-1較雄2-10最好

酒精

70-75易0.2-2好

過(guò)氣化氫10-12最易5-15好

漢水1-2步2-10很好

硝酸根1較難5-30好

抗菌素4—50mgL—1中30-60較好

酒精：70%-75%的酒精，滲透能力強(qiáng)，一般15s-30s（有時(shí)可在其中加入0.1%

的酸或堿，H+、OH-可以改變細(xì)胞膜帶電荷的性質(zhì)，從而改變膜透性，增強(qiáng)其

消毒效果\

升汞：重金屬，有劇毒，是蛋白變性，酶失活。殘留不易去除，反復(fù)沖洗，至少

5次?；厥諒U液。

次氨酸鈉：易去殘留，對(duì)植物傷害?。?%-10%）

漂白粉：漂白粉中一般含有10-20%的次氨酸鈣，配置成5%-10%的溶液即可，

它易吸潮失去有效氯而失效,故須密封貯藏。

雙氧水：6%-12%的濃度，通常用于葉片的消毒。

新潔爾滅:通常用200倍稀釋液，浸泡外植體30min,甚至更長(zhǎng)

消毒過(guò)程中可以借助吐溫、超聲波等加強(qiáng)消毒力度。消毒劑使用后需用無(wú)菌水

沖洗4-5遍，確保無(wú)殘留。消毒完成后，將外植體修剪成所需大小，接種至事先

準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基內(nèi)。

七、植物組培快繁體系

啟動(dòng)培養(yǎng)：又叫誘導(dǎo)培養(yǎng)，需激素水平相對(duì)較高。不能獨(dú)保無(wú)污染，一般一瓶?jī)?nèi)

接1-2個(gè)外植體即可，一般需要4-6周。分為叢生芽（側(cè)芽萌發(fā)，形成一枝多

芽，多枝多芽的狀態(tài)X不定芽（從愈傷組織中產(chǎn)生的小芽\胚狀體發(fā)育（體細(xì)

胞胚，與生殖細(xì)胞形成的合子胚類似X原球莖發(fā)育

繼代培養(yǎng)（增殖培養(yǎng)）：切斷或者分株，增殖率不宜過(guò)大，易變異。增殖率成積

數(shù)倍數(shù)增加。

生根培養(yǎng)：如果瓶苗較弱,生根培養(yǎng)前需要有個(gè)壯苗的過(guò)程（根據(jù)材料種類及生

產(chǎn)計(jì)劃調(diào)整，可選取壯苗進(jìn)行生根培養(yǎng)，弱小的繼續(xù)增殖分化，同時(shí)進(jìn)行），壯

苗可使用赤霉素和多效喋。

試管內(nèi)生根和試管外生根（也可結(jié)合使用，在試管內(nèi)誘導(dǎo)根源基，試管外根源基

伸長(zhǎng)）

生根與生長(zhǎng)素有關(guān)，一般生根需要較低鹽分，較低糖濃度，光照加強(qiáng)

馴化煉苗：試管苗培養(yǎng)在弱光、恒溫、高濕、無(wú)菌、養(yǎng)分充足的環(huán)境下，它的角

質(zhì)層薄、水孔多、氣孔的生理活性差，保水能力差，葉綠體的光合性能差，根系

不發(fā)達(dá)，吸收能力差，直接移植自然條件下無(wú)法適應(yīng)，因此需要煉苗馴化，這是

一個(gè)循序漸進(jìn)的過(guò)程。光照,濕度，溫度逐漸變化，接近自然條件。

移植時(shí)間：最好選在其自然出苗季節(jié)。

移栽設(shè)施：營(yíng)養(yǎng)缽（占地大，耗用基質(zhì)X穴盤（省空間，省基質(zhì)，但需二次移

苗）

移栽基質(zhì)：保濕、透氣、保肥；基質(zhì)使用前需進(jìn)行滅菌（常用500、800、1000

倍多菌靈X常用基質(zhì)：珍珠巖、蛭石、草炭土、椰糠、水草、稻殼、陶粒等。

注意:水肥管理

八、植物組培的培養(yǎng)條件

溫度：大部分植物的適宜溫度為23-27度，不同植物也大不相同（百合20度，

月季25-27度，番茄28度），所需溫度基本與原產(chǎn)地相同，多數(shù)熱帶植物則需

要30度左右生長(zhǎng)較好。

香石竹在18-25度之間會(huì)隨溫度降低生長(zhǎng)速度減慢，但苗的質(zhì)量顯著提高。

唐菖蒲和百合的小鱗莖或植株則需要在2度低溫下處理4-6周，再定植田間方

可成活。

有些植物則需要較大的晝夜溫差（土豆）

濕度：主要受培養(yǎng)基水分和封口材料的影響，一般相對(duì)濕度在70%-80%之間

培養(yǎng)室內(nèi)干燥可灑水，加濕器；潮濕可配用除濕機(jī)

濕度過(guò)低會(huì)使培養(yǎng)基內(nèi)水分喪失，導(dǎo)致培養(yǎng)基內(nèi)各種成分濃度的改變和滲透壓升

高。濕度過(guò)高會(huì)造成污染和玻璃化。

冬季天氣干燥，可減少瓊脂用量，夏季可增加用量。

光照：光在組培中主要是滿足植物形態(tài)建成的需要和進(jìn)行小部分的光合作用

絕大多數(shù)植物2000-3000LX可足夠，一般10-14小時(shí)之間，在生根過(guò)程中可加

大光照。

滲透壓：溶液滲透壓，簡(jiǎn)單地說(shuō)是指溶液中溶質(zhì)微粒對(duì)水的吸引力，溶液滲透壓

的大小取決于單位體積溶液中溶質(zhì)微粒的數(shù)量，溶質(zhì)微粒越多，對(duì)水的吸引力越

大，溶液滲透壓越高。

PH及培養(yǎng)基的硬度：高溫滅菌會(huì)降低PH0.2-0.3

氣體狀況：高溫滅菌會(huì)使瓶?jī)?nèi)產(chǎn)生乙烯，苗木自身在瓶?jī)?nèi)也會(huì)產(chǎn)生乙烯，長(zhǎng)時(shí)間

累計(jì)會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用,利用通氣性較好的封口材料，恰當(dāng)掌握接種密度，

及時(shí)轉(zhuǎn)接。液體培養(yǎng)要配上搖床，增加氧氣交換，固體可加活性碳增加通氣性。

九、植物組織培養(yǎng)常見問(wèn)題及防治措施

污染

細(xì)菌：呈粘液狀，多為白色，也有黃色和紅色

真菌：多位黑色、白色、褐色、綠色，呈絨毛狀或棉絮狀。

污染的原因：外植體滅菌不切底

操作時(shí)人為帶入

培養(yǎng)基或接種工具滅菌不徹底

環(huán)境不清潔（有塵就有菌）

保持無(wú)菌環(huán)境的措施

培養(yǎng)室環(huán)境滅菌：紫外線殺菌20-30min

臭氧發(fā)生器殺菌l-2min/平米

空氣凈化器

熏蒸殺菌（10ml甲醛+5g高鎰酸銅/立方米，先把高鎰酸鉀

溶解,再把甲醛倒入；冰醋酸加熱；流磺熏蒸；一般在新建組

培室內(nèi)使用\

噴霧殺菌：70%-75%酒精，新潔爾滅等噴灑。

培養(yǎng)基滅菌：高溫高壓滅菌（121度，0.1MP下20-30min）

接種工具滅菌：高溫高壓滅菌（濕熱滅菌）

干熱滅菌（烘箱內(nèi)