臨床富血小板血漿介紹、分類、制備技術及質量控制要點

臨床富血小板血漿介紹、分類、制備技術及質量控制要點富血小板血漿（PRP）制備技術是一種高度異質性的技術，目前尚無統(tǒng)一標準。采血量、抗凝劑、離心設備、離心參數(shù)、激活方式、PRP制備量等差異性較大，血小板富集度、血小板回收率、白細胞清除率、紅細胞清除率等指標不穩(wěn)定，缺乏統(tǒng)一的PRP質量評價標準。所有這些因素導致PRP研究結果往往不能重復或不一致，嚴重制約了PRP的臨床推廣應用，因而亟需建立一套穩(wěn)定可靠的PRP制備技術規(guī)范來指導PRP制備。PRP概述血小板簡介血小板是一種從巨核細胞上脫落的細胞質小塊，是哺乳動物血液中的有形成分之一。成年人血液中血小板濃度為（100～300）×109/L，平均壽命7～14d，每日約更新總量的1/10。性別、年齡、種族、身高、季節(jié)、早晚、運動、生理周期等不同，不僅血小板濃度有一定程度的生理性波動，而且會影響PRP的制備效率。一般情況下，血小板呈雙凸盤狀，受到刺激后會伸出足突，呈不規(guī)則狀，具有明顯的異質性。血小板有質膜，沒有細胞核。細胞質呈淡藍色，含有a顆粒、致密顆粒（d顆粒）、溶酶體（l顆粒）等。血小板受到刺激后會發(fā)生粘附、聚集、釋放、收縮及吸附，在止血、傷口愈合、炎性反應、血栓形成、器官移植排斥等生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。PRP概念PRP是全血經分離后得到的富含高濃度血小板的血漿。1993年，Hood等首先提出PRP概念。由于目前PRP制備多采用自體全血，所以PRP通常都是指自體PRP，主要含有血小板、纖維蛋白、白細胞等成分。血小板中α顆粒在血小板激活后釋放大量生長因子，如血小板衍生生長因子（PDGF）、轉化生長因子β（TGFβ)、類胰島素生長因子（IGF）、表皮生長因子（EGF）、血管內皮生長因子（VEGF）等，各種生長因子的比例與體內生理狀態(tài)比例相符，在加速傷口愈合、促進組織再生修復、緩解疼痛等方面扮演了非常重要的角色。由于PRP是從自體血液中提取，來源豐富、取材方便、制備簡單、安全有效，近幾年已廣泛應用到骨科、疼痛科、口腔頜面外科、心胸外科、醫(yī)學美容科、皮膚科、康復醫(yī)學科、耳鼻喉科、婦產科、眼科、泌尿外科、兒外科、神經外科等學科領域，具有廣闊的應用空間和發(fā)展前景。PRP分類根據(jù)所用的PRP制備技術、產生的PRP中不同成分含量等，PRP有很多分類系統(tǒng)，比如DohanEhrenfest、Mishra、PAW、PLRA、DEPA、MARSPILL、血小板生理學小組委員會分類、PRP分類和編碼系統(tǒng)等分類系統(tǒng)。這些分類系統(tǒng)在一定程度上解決了不同數(shù)據(jù)之間無法比較的問題，有利于臨床根據(jù)不同使用目的及情況，確定更適合的PRP，提供更好的治療方案。目前臨床上常用的分類方法主要是根據(jù)白細胞含量及PRP應用形式進行分類。根據(jù)白細胞含量不同分類白細胞與血小板的沉降系數(shù)很相近，含量都相對較少，采用密度梯度離心法很難將兩者完全分開。根據(jù)所含白細胞濃度的不同，PRP可分為含高濃度白細胞的富白細胞富血小板血漿（LPRP）以及不含或僅含低濃度白細胞的貧白細胞富血小板血漿（PPRP）。LPRP比PPRP具有更高的血小板濃度和白細胞濃度、釋放更高濃度的生長因子。LPRP抗炎作用強，能更持久地釋放生長因子、纖維膠原等，更適合被應用于創(chuàng)傷組織的修復，但白細胞釋放炎癥因子引發(fā)局部的免疫反應可能抑制組織修復、降低PRP臨床療效、增加注射部位疼痛等。PPRP在骨關節(jié)炎治療及各類手術中效果較好，近年來獲得了越來越廣泛的關注。根據(jù)PRP應用形式分類(1)激活型PRP（外源性激活PRP）PRP萃取液指血小板被激活后，釋放的生長因子與血漿及血漿中原有的活性蛋白成分一起形成的混合液。PRP凝膠指血小板被激活后釋放生長因子的同時，其纖維蛋白原轉變?yōu)槔w維蛋白，并連接成網，所形成的乳白色膠狀物，具有一定強度和黏附性。(2)未激活型PRP（內源性激活PRP）人體內有足夠量的內源性凝血酶原激酶、膠原蛋白等，一旦未激活型PRP注射入人體，就會被體內凝血酶、膠原蛋白等激活，緩慢釋放生長因子。制備技術如何進行有效分離和提高PRP中血小板濃度并保持血小板的活性是PRP制備技術的關鍵。標準化制備的PRP可為基礎研究和臨床應用提供可靠的質量保證，但目前PRP制備技術尚未形成統(tǒng)一的標準。PRP制備技術根據(jù)制備原理的不同可分為密度梯度離心法和濾膜式分離法，前者是利用離心力將不同沉降系數(shù)的血液成分分層分離，后者是通過濾膜過濾的方法獲得一定顆粒大小的血液成分，如血小板等，目前臨床上主要使用密度梯度離心法制備PRP。密度梯度離心法密度梯度離心法是根據(jù)血液中各組分沉降系數(shù)的不同（表1），從全血中分離提取出PRP。不同的離心力、離心次數(shù)、離心時間及離心溫度所制備的PRP中血小板濃度和活性也會有差異。根據(jù)制備工具不同分類密度梯度離心法根據(jù)制備工具不同可分為PRP制備套裝法、血細胞分離機單采法、手工一體性血袋法和手工試管法。(1)PRP制備套裝法PRP制備套裝是一類專門用于制備PRP的整套裝置，包括采血和離心材料，通常配備專用的離心機。使用的PRP制備套裝須是在國家藥品監(jiān)督管理局注冊的Ⅲ類醫(yī)療器械。PRP制備套裝多在半封閉或全封閉狀態(tài)下采集和制備，一次采集一次使用，制品安全性相對較高，操作簡單。PRP制備套裝種類繁多，制備方法各異，PRP產量及血小板富集度相差很大，臨床應用時要注意相互之間的差別。①二次離心法PRP制備套裝如山東威高PRP制備套裝、韓國瑞維PRP制備套裝等。采用二次離心法制備PRP，不僅血小板富集度和血小板回收率較高，而且可以通過對第一次離心后分離的三個部分吸取比例的不同實現(xiàn)制備LPRP或PPRP。②一次離心法PRP制備套裝如瑞士瑞珍PRP制備套裝、德國銳適PRP制備器、美國泰爾茂比司特PRP制備套包等。單次離心后直接吸取中間層，獲得PRP。部分品牌的制備套裝還聯(lián)合使用專用血小板分離膠/濾膜獲得PRP。(2)血細胞分離機單采法離心式血細胞分離機以全自動方式分離血小板，同時將紅細胞、白細胞和血漿回輸?shù)焦┭唧w內。本法是在全密閉條件下操作，不易污染，一次可采集較多血小板，滿足分次使用，而且供血者自體血液損失少，所得血小板純度高、濃度高。但此法所需設備價格昂貴，多為血液制品相關機構或科室使用，主要用于輸血性血小板輸注治療，總體成本較高，而且儲存的血小板分次使用可能會影響血小板活性，與臨床科室實際需求存在一定的差距，所以目前并未在臨床上廣泛應用。(3)手工一體性血袋法離心方法可用富漿法或白膜法。使用串聯(lián)的血袋在密閉狀態(tài)下采血、分離和制備PRP，安全性高，也可一次采集較多血小板，其余血液成分可回輸供血者體內。其缺點是所需環(huán)境和設備要求高，操作復雜，歷時長，難以在臨床廣泛使用。(4)手工試管法試管法手工采集全血制備PRP，主要有Anitua、Petrungarp、Landesberg及Aghaloo等四種方法。這類制備方法操作簡單、設備要求低，成本低，但其開放式制備方式容易受到外界污染，制備的PRP質和量易受操作者習慣等影響，在國家藥品監(jiān)督管理局批準注冊PRP專用離心管之前，臨床上不推薦使用手工試管法制備PRP。①應用無菌采血管代替PRP離心管由于無菌采血管是Ⅱ類醫(yī)療器械，未進行特定的生物學檢驗檢測，安全性較低，不能滿足國家Ⅲ類醫(yī)療器械管理的規(guī)定要求，如果用來替代PRP離心管，一方面未按注冊預期用途使用，另一方面也不安全。②利用無菌注射器改裝成PRP離心管雖然無菌注射器是Ⅲ類醫(yī)療器械，但利用無菌注射器改裝成離心管，用來制備PRP，屬于未按注冊預期用途使用，而且采集和制備過程為開放性操作，存在較高的污染風險。③使用尚未在國內注冊的PRP專用離心管不推薦使用國外或國內生產的尚未在國內注冊的PRP專用離心管。根據(jù)離心力不同選擇分類PRP制備可用一次、二次或三次離心法，其中二次離心法提取的PRP質量較高，在臨床上應用最廣泛。二次離心法根據(jù)離心力選擇的不同又可分為富血小板血漿法和白膜法。(1)富血小板血漿法（富漿法）第一次離心為輕離心，使全血分兩層。紅細胞和白細胞沉淀形成下層，而上層中血小板不沉淀，形成富含血小板的血漿層；取上層富含血小板血漿，行第二次離心，為重離心，使血小板沉淀，棄去部分上層的貧血小板血漿后，形成符合要求的PRP。本法的特點是血小板回收率高，但白細胞和紅細胞殘留率也較高。(2)白膜法同樣包括兩次離心。首先將全血重離心，形成三層，即貧血小板血漿層、白膜層（血小板、白細胞層）和少白細胞的紅細胞層。然后分離白膜層，行第二次離心（輕離心），得上清液為少白PRP。本法的特點是所得PRP中白細胞混入少，但血小板回收率偏低。濾膜式分離法人體全血中血小板直徑為2～3μm，紅細胞平均直徑為9μm左右，白細胞直徑為7～20μm，濾膜式分離法是利用特定孔徑濾膜的分子篩特性，將全血中不同顆粒大小的成分（紅細胞、白細胞等）與血小板分離的方法。比如第一層大孔徑膜截留紅細胞和白細胞，第二層小孔徑膜獲得血小板，洗脫后形成符合要求的PRP。濾膜式分離法也可與離心法組合使用，以提高PRP制備純度和效率。PRP制備對醫(yī)療機構基本要求機構資質要求雖然目前PRP制備及臨床應用尚無嚴格統(tǒng)一標準的醫(yī)療機構資質要求，但考慮到PRP是血液相關制品，PRP制備必須遵循血液制品制備和使用規(guī)范，具備嚴格的無菌條件及操作流程，符合國家規(guī)定的衛(wèi)生標準和要求。制備環(huán)境要求空間布局。設置PRP制備無菌治療室或手術室，面積應滿足PRP采集及制備工作需求。治療室內空間布局合理，治療床、操作臺、儀器設備、無菌物品等有序擺放。治療室制度、技術操作規(guī)范與流程圖上墻。衛(wèi)生環(huán)境。PRP制備需在潔凈室條件下進行，采血、制備等工作區(qū)域環(huán)境須達到醫(yī)院消毒衛(wèi)生國家標準中的Ⅱ類及以上環(huán)境標準要求。無法達到潔凈室標準的醫(yī)療機構應配置超凈工作臺，在超凈工作臺內完成PRP制備。無菌操作。須使用無菌預防措施制備PRP。操作前，醫(yī)務人員應佩戴一次性口罩和帽子，手消毒，穿戴無菌的一次性手套，制備過程中嚴格遵循技術規(guī)范，保證全程無菌操作，防止感染事件的發(fā)生。制備場地要求基本設施。PRP制備應符合感染控制要求，無菌區(qū)、緩沖區(qū)、污染區(qū)布局合理，醫(yī)務人員及患者通道相對獨立。治療室內配置層流系統(tǒng)或必要的消毒設施，安裝溫度調節(jié)裝置，設置必要的供氧及負壓吸引系統(tǒng)?；驹O備(1)PRP制備設備。離心機是必備的設備，建議配備PRP專用離心機。冰箱、酶標儀、血細胞分析儀、血小板震蕩保存箱、生物安全柜或超凈工作臺等都屬于可選設備，根據(jù)所在單位的實際情況有選擇地配備。(2)搶救設備。如呼吸機、簡易呼吸器、氣管插管等。(3)監(jiān)護設備。如多功能生命體征監(jiān)測儀、聽診器、血壓計、體溫計等。搶救藥品(1)補充體液類。5%、10%葡萄糖注射液，0.9%氯化鈉溶液等。(2)抗過敏抗休克類。地塞米松、腎上腺素、阿托品、多巴胺等。(3)抗驚厥類。地西泮、硫酸鎂等。(4)呼吸興奮劑。尼可剎米等。(5)其他。必要的鈣劑、止吐及其他藥品。所有藥品須在有效期內使用，存藥近效期前應及時更新為較新批號的藥品。制備人員資質要求PRP制備應當由具有執(zhí)業(yè)醫(yī)師資格、執(zhí)業(yè)護士資格等醫(yī)療資質人員操作。制備者需經過嚴格的無菌操作培訓和PRP制備技術培訓并取得培訓合格認證，熟練掌握PRP制備的基礎理論知識和相關操作流程，熟悉PRP配套耗材及制備設備的使用方法，對可能的設備故障等具有初步應急處理能力。PRP制備需要的材料PRP制備所用材料應符合國家或/和行業(yè)的相關標準，滿足Ⅲ類醫(yī)療器械管理規(guī)定。試劑抗凝劑、激活劑、生長因子檢測試劑盒等。耗材PRP制備套裝。專用于PRP制備而設計的整套制備耗材，國產PRP制備套裝（如山東威高等）和進口PRP制備套裝（如韓國瑞維、瑞士瑞珍、德國銳適、美國泰爾茂比司特等）均為Ⅲ類醫(yī)療器械。單采機配套耗材。成分血單采機一次性配套耗材為Ⅲ類醫(yī)療器械。自配耗材。在國家藥品監(jiān)督管理局批準注冊PRP專用離心管之前，臨床上不推薦自配耗材制備PRP。設備見制備場地要求中基本設備內容。PRP制備系統(tǒng)模式完全開放系統(tǒng)將PRP制備暴露在工作區(qū)域內環(huán)境中，與制備PRP所需的材料和設備接觸。雖然這種系統(tǒng)成本低、方便快捷，但存在血小板易被激活、感染控制風險高、制備效率難均一等問題。半密閉系統(tǒng)采血后，將血液注入密閉制備套件中，通過制備套件內部的分離分割裝置制備PRP，制備過程中血液處于密閉系統(tǒng)。這種系統(tǒng)具有方便快捷、成本稍高、感染風險較低、制備效率高等特點。制備環(huán)境要求同開放式系統(tǒng)。完全密閉系統(tǒng)整個制備過程都在密閉容器內完成，不與外界直接接觸，避免轉移操作中的污染和血小板激活。優(yōu)先選擇在完全封閉系統(tǒng)內采集制備PRP，以防止血液和細胞組分暴露在空氣中受到污染。雖然這種系統(tǒng)感染控制風險較低、容易質控，但存在價格昂貴、高紅細胞污染等問題。PRP的制備流程患者評估

一般情況評估患者性別、年齡、健康狀況、既往病史、心理狀態(tài)、教育程度、經濟狀況等。疾病主訴、現(xiàn)病史、治療經過、治療效果、治療需求等。詳細的體格檢查，以及必要的影像學檢查、實驗室檢查等。排除治療影響因素，妥善進行醫(yī)患溝通和患者教育，操作前簽署知情同意書。禁忌證排查(1)絕對禁忌證。血小板功能障礙綜合征、重度血小板減少癥、血液動力學不穩(wěn)定、脾功能亢進、敗血癥、注射部位或手術部位存在局部感染、不愿意接受血液制品治療風險者、明確患有心理疾病、對治療期望值過高等患者禁用PRP。(2)相對禁忌證。以下情況慎用PRP：服用NSAIDS類藥物停藥未超過48h；1個月內治療部位局部注射糖皮質激素；全身性使用糖皮質激素停用未超過2周；抗凝藥停用未超過5d；近期發(fā)熱或其他疾?。ㄗ陨砻庖咝裕┗颊?；惡性腫瘤（尤其是造血系統(tǒng)或骨骼系統(tǒng)腫瘤）患者；血紅蛋白<100g/L，血小板計數(shù)<100×109/L等。注意事項避開女性月經期等。采血采血條件。采血前應對患者進行安全性綜合評估，確?；颊呱眢w機能處于良好狀態(tài)；檢查患者備采血血管充盈良好，局部皮膚無異常表現(xiàn)；采血環(huán)境符合無菌要求等。安全檢查。相關試劑、耗材包裝完好，生產日期及失效期標注明確，且在有效保質期內；制備設備、監(jiān)護設備、搶救設備、搶救物品等狀態(tài)良好；消毒設施及溫度調節(jié)裝置處于良好工作狀態(tài)等。操作規(guī)范。嚴格執(zhí)行查對制度，遵守無菌操作及PRP制備等相關操作規(guī)范和指南，采血過程中密切關注患者反應，及時處理各種可能的意外情況。采血操作(1)采血部位。采血部位常規(guī)選取肘部靜脈，也可采用其他部位作為備選方法，如尺動脈、橈動脈、股靜脈等。如果患者過度肥胖或其他原因造成體表血管難以定位時，可考慮使用超聲儀器引導下輔助定位。(2)血液類型。多數(shù)采集靜脈血，少數(shù)采集動脈血。(3)采血方法。操作者佩戴無菌手套，對患者皮膚常規(guī)消毒后，用采血針進行穿刺采血，等待軟管中出現(xiàn)血液，將采血針與PRP制備套裝中采血管或注射器連接。(4)血液混勻。血液采集完畢后，操作者需將采血管輕輕地反復倒置幾次，使抗凝劑與血液充分混合，防止血液凝固。血液和抗凝劑混勻后取適量（約0.1ml）混合血用于測定其中血液中血小板的數(shù)量，以便用于后續(xù)過程比照和監(jiān)控。(5)采血量。抽取全血量通常為8～50ml，常用采血量為30ml。抽取的血液量根據(jù)所需的PRP量和血小板富集度不同而有所變化，比如要制備5ml的PRP，假如血小板富集度為5倍，血小板回收率為80%，那至少需要抽取31.25ml（5×5÷80%=31.25）血液。(6)采血針。建議使用寬口徑針，最好是21G或更粗的針頭或蝴蝶套管用于抽血，以避免血小板意外激活。(7)采血時間。臨床上基本采用“現(xiàn)采現(xiàn)制”，少數(shù)采用庫存血來提取PRP。如果從抽血到離心開始所耗的時間超120s，會減少23%的PRP產量?？鼓齽㏄RP制備過程中，抗凝劑的選擇非常重要。是否加抗凝劑及何時加抗凝劑都會影響PRP中組分構成和生長因子的濃度?？鼓齽┓旁谠嚬?、注射器或血袋中，能夠避免血小板的自我激活。一旦血小板激活，大量生長因子釋放出來，PRP生物學效應就會下降?？鼓齽┓N類。選擇正確的抗凝劑是制備PRP的關鍵步驟。常用的抗凝劑主要有檸檬酸葡萄糖A（ACDA）、檸檬酸鹽磷酸葡萄糖（CPD）、乙二胺四乙酸（EDTA）、肝素等。(1)ACDA。又名枸櫞酸鈉，是制備PRP的首選抗凝劑。ACDA具有更低的pH值和細胞外鈣離子濃度，能夠較長時間保持血小板結構的完整性，降低血小板的活化率，預防血小板聚集。研究表明ACDA制備PRP可獲得較高的血小板濃度，且血小板形態(tài)良好，細胞碎片及聚集體最少。(2)CPD?？勺鳛橹苽銹RP的備選抗凝劑。但與ACDA相比，其PRP制品中血小板計數(shù)較少，且細胞因形態(tài)改變、結塊或無細胞碎片的產生等可能會對PRP的生物學效應產生影響。(3)EDTA。對血小板膜具有破壞作用，使得PRP制品中含有大量非細胞碎片及聚集體，不推薦用于PRP制備。(4)肝素。肝素與血小板表面結合可引起血小板聚集、釋放、破壞，造成血小板功能下降，不推薦用于PRP制備?？鼓齽┯昧?。建議抗凝劑體積與采血量的比例為1∶9或1∶10。離心PRP制備的核心步驟是離心。PRP最終制備效果與相對離心力、離心次數(shù)、離心時間、離心溫度等密切相關，臨床中應根據(jù)治療需求、環(huán)境及設備的不同，選擇合適的離心參數(shù)。在無菌環(huán)境下進行離心，離心機必須始終保持水平，離心管必須相互保持平衡。相對離心力（RCF）RCF是離心機產生的離心力。離心機通過聯(lián)軸器帶動轉頭高速運轉所產生的RCF可使全血中不同沉降系數(shù)的血液成分有效分離。RCF的大小取決于樣品所處的位置至軸心的水平距離即旋轉半徑r和轉速n，其計算公式為RCF=1.118×10-5?n2?r×g，其中n指轉速（rpm），r指旋轉半徑（cm），g為重力加速度。PRP制備時，無論所用離心機類型如何，RCF都是相同的。RCF參數(shù)的大小對PRP中血小板的濃度、形態(tài)結構、分布密度及生長因子的釋放等均有影響。較高的RCF所產生的高剪切應力可能會導致血小板破壞過多，或血小板激活誘導血小板自發(fā)聚集，減少PRP中生長因子釋放，并進一步影響到臨床效果。一次離心法中，常見的離心力設置范圍150～1500g，轉速設置范圍400～3400rpm。不同廠家的PRP制備套裝，不同的醫(yī)務人員選擇的離心參數(shù)都可能不一樣。在二次離心法中，第一次離心參數(shù)為離心力100～300g，離心時間5～10min，第二次離心參數(shù)為離心力400～700g，離心時間10～17min。離心次數(shù)制備PRP通常分為一次離心法、二次離心法和三次離心法。一次離心法常需較大RCF，盡管操作簡單，但制備的PRP中血小板濃度較低，生長因子含量相對較少。二次離心法獲得的PRP中血小板含量和血小板回收率均較高，但紅細胞混入量相對較高。三次離心法操作相對繁瑣，與二次離心法相比，雖可獲得血小板純度更高的PRP，但也會導致血小板回收率下降，目前臨床上幾乎很少采用。目前臨床上PRP制備主要采用二次離心法（80.2％），一次離心法較少（18.8％）。離心時間離心時間對制備的PRP中血小板濃度及活性有較大影響。離心時間過短，PRP中血小板濃度難以達到治療需求，但長時間高速離心則可能破壞血小板細胞膜而影響生長因子釋放。因此，應根據(jù)臨床需求合理選擇離心參數(shù)，當RCF較大時，離心時間應盡量短，RCF較小時，離心時間可適當延長。目前臨床上離心時間通常是5～15min。第一次離心時最常見的時間設置為10min（78.1％），第二次離心時最常見的時間設置為10min（70.3％）,這樣制備的PRP血小板含量較高。離心溫度溫度過高或過低都會影響血小板的活性。常溫臺式離心機的離心速度越大，離心管表面的溫度越高，過高的溫度可能會導致血小板提前激活，致使血小板回收率下降。美國血庫學會推薦PRP的離心溫度為21～24℃，可獲得更佳的血小板回收率。離心機(1)離心機類型①普通離心機和溫控離心機相較于普通離心機，溫控離心機可以設定并維持PRP制備溫度，提高PRP制備效率，但并非制備PRP所必需。②固定角度離心機和水平式離心機固定角度離心機由于向后的離心力，細胞首先被推到管的遠端，然后沿著管后壁向上或向下移動，可能導致試管后端的細胞活化或損傷；水平式離心機中血小板、紅細胞等成分的運動則不受阻礙。PRP制備時優(yōu)先選擇水平式離心機。(2)離心機要求只有刻度盤且沒有數(shù)字顯示的離心機不得用于PRP制備，因為無法設置所需的RCF。建議選擇合適的PRP制備專用離心機，離心操作簡單，無需設置參數(shù)，只需離心按鍵即可完成離心，不僅使用方便，而且可有效防止人為誤差。離心管(1)材料要求離心管材料屬性在PRP制備中起著重要作用。玻璃管具有親水性，允許血小板與管壁接觸激活并促進凝血；塑料管和PETA管是疏水性，可以排斥血小板，防止在離心過程中血小板激活，延遲血凝塊的形成。制備PRP時，塑料離心管優(yōu)于玻璃離心管。(2)容量要求根據(jù)所需制備的PRP量及采血量，選擇合適容量的PRP離心管，臨床上離心管容量多為10～50ml。(3)形狀要求離心管形狀不同可能影響PRP提取效率，臨床上主要有普通試管形狀、窄管形狀、特殊形狀等。(4)離心管是否預裝抗凝劑獨立的PRP專用離心管通常預裝抗凝劑，部分PRP制備套裝中離心管預裝抗凝劑。(5)離心開始時間為避免所采集的全血中血小板損失和失活，采血完成后應立即將血液轉移至裝有抗凝劑的離心管并搖勻，第一時間置于離心機中開始離心。抽取離心后必須立即將

PRP

與貧血小板血漿（PPP）分離，因為濃縮的血小板會隨著時間慢慢擴散到PPP中。操作人員的個人習慣、拿捏尺度、熟練程度等均會影響PRP制備效率。PRP制備量PRP制備量根據(jù)臨床治療需求的不同而有較大差異，文獻報道其范圍0.4～30ml不等。一般來說，PRP制備量約占離心前全血（含抗凝劑）體積的12.9％。激活PRP制備完畢后，需要使用相應的激活劑來激發(fā)它的生物學活性，激活劑的選擇對生長因子的釋放方式及釋放量有明顯影響。血小板激活概念在正常血循環(huán)中血小板處于無活性狀態(tài)，當血管內皮損傷等凝血因素啟動后，血小板被激活。血小板活化包括血小板粘附、聚集和釋放三個過程，幾乎同時發(fā)生。能引起血小板聚集的因素，多數(shù)能引起血小板釋放反應。血小板釋放是指血小板受刺激后將儲存在d顆粒、α顆?；騦顆粒內的物質排出的現(xiàn)象。d顆粒釋放二磷酸腺苷、三磷酸腺苷、5羥色胺、鈣離子等；α顆粒釋放β血小板球蛋白、血小板因子4（PF4）、vWF、纖維蛋白原、凝血因子V（FV）、PDGF、TGFβ、IGF、EGF、VEGF等。血小板激活方式(1)外源性激活（體外激活）PRP使用前在體外通過化學方式或物理方式使血小板激活，稱為外源性激活。血小板激活導致生長因子快速釋放，10min內可釋放大部分生長因子。鑒于許多生長因子的半衰期很短，在注射時或注射前激活PRP，可能會產生最大的生物學效果。一旦PRP被激活，纖維蛋白網絡即開始形成，凝固血漿并形成纖維蛋白凝塊或膜。常用的化學激活劑包括凝血酶、10%氯化鈣等，物理激活方式有創(chuàng)傷、光照、冷熱、凍融等。關于是否需要外源性激活的問題仍存在爭議，因為不同的PRP激活劑會影響最終產物的物理形態(tài)，也可能影響生長因子的釋放曲線。臨床中某些特殊治療需要外源性激活，如PRP治療骨折等硬組織時必須使用激活的PRP。目前臨床大多數(shù)商用PRP制備套裝通常不行體外激活PRP。(2)內源性激活（體內激活）未激活的PRP注入機體后，在體內與纖維狀膠原蛋白、凝血酶等接觸時會被激活，稱為內源性激活。膠原蛋白、體內凝血酶等是PRP的天然激活劑，也是一種較弱血小板激活劑。內源性激活可使生長因子長時間持續(xù)釋放，與外源性激活相比，其應用于軟組織時PRP效率更高。血小板激活檢測血小板被激活后會釋放β血小板球蛋白、PF4、P選擇素、D二聚體、顆粒膜蛋白140（GMP140）等，臨床上可通過測定這些分子的含量，來了解體內血小板的活化情況。保存保存溫度PRP在4、22、37和-80℃保存均有報道，部分學者推薦22℃震蕩保存。但低溫會啟動血小板內的活化過程，導致聚集和細胞死亡；而室溫保存時，介質中細菌生長有導致PRP制品污染的風險。因此建議PRP制備后立即使用，以保障最佳治療效果及治療安全。保