免疫熒光原位雜交技術(shù)FISH

FISHhays什么是FISH?熒光原位雜交（Fluorescence

in

situ

Hybridization，F(xiàn)ISH）基本原理：應(yīng)用熒光染料標(biāo)記探針

DNA，變性成單鏈后與變性后的染色體或細(xì)胞核靶DNA雜交，在熒光顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果。概述FISH

探針?lè)N類(lèi)CSP著絲粒探針GLP特異性位點(diǎn)探針FISH操作簡(jiǎn)單快速出結(jié)果標(biāo)本來(lái)源豐富靈敏度特異性高準(zhǔn)確率高FISH診斷的優(yōu)勢(shì)FISH在石臘切片標(biāo)本中的應(yīng)用FISH在產(chǎn)前診斷的應(yīng)用FISH結(jié)果分析及注意事項(xiàng)二甲苯脫蠟梯度乙醇復(fù)水沸水煮30min37oC蛋白酶k5-30min變性雜交2XSSC漂洗2次石蠟切片標(biāo)本處理基本步驟：2XSSC漂洗2次梯度脫水洗片閱片DAPI染色脫蠟石蠟切片浸于二甲苯中3次,每次10分鐘浸入100%的乙醇中5分鐘.然后梯度復(fù)水各2分鐘浸入去離子水3分鐘(脫蠟不足會(huì)導(dǎo)致探針雜交強(qiáng)度和雜交率降低,熒光背景高等)預(yù)處理100

oC沸水處理組織切片30分鐘100ug/mL的蛋白酶K溶液,37

oC孵育5-30分鐘2*SSC漂洗,梯度脫水各2分鐘,干燥玻片.變性雜交洗滌DAPI復(fù)染50%甲酰胺2XSSC0.1%NP-4075%乙醇探針變性玻片變性83

oC5min42oC

濕盒孵育過(guò)夜羊水處理的步驟玻片制備懸液滴片及預(yù)處理變性雜交加探針變性雜交過(guò)熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)羊水標(biāo)本玻片的制備離心胰酶消化低滲（0.075M

KCL）預(yù)固定、固定滴片（控制好懸液濃度、量、高度）胰蛋白酶（Trypsin）消化操作中要控制好酶的工作濃度,適量加大酶有助于加強(qiáng)消化作用,但盲目加大酶量超過(guò)酶飽和度不一定起到加強(qiáng)消化的作用。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)控制好酶的工作濃度,不同批次、不同儲(chǔ)存時(shí)間及溫度影響酶消化強(qiáng)度及飽和度。低滲處理和固定細(xì)胞置于KCL低滲溶液中吸收水分可使細(xì)胞脹破，使探針更容易與核內(nèi)DNA雜交結(jié)合，便于結(jié)果分析。固定液（乙酸和甲醇1：3配比）加入后形成核蛋白交聯(lián)定型。提高細(xì)胞核與載玻片的親和力，使探針DNA易于進(jìn)入細(xì)胞。預(yù)處理37

oC

PBS

5min37

oC

0.005%胃酶15min1xPBS

3min1%多聚甲醛10min1xPBS

3min

2次梯度脫水胃蛋白酶處理胃蛋白酶處理可以取出細(xì)胞漿中的蛋白質(zhì)，減少探針在載玻片上與核酸和蛋白質(zhì)的非特異結(jié)合，提高雜交效率。變性雜交變性使DNA變性保持單鏈結(jié)構(gòu)雜交

濕潤(rùn)密閉環(huán)境結(jié)果分析洗滌DAPI復(fù)染鏡下觀察計(jì)數(shù)FISH結(jié)果分析及注意事項(xiàng)FISH成像分析系統(tǒng)熒光顯微鏡的使用自己眼睛的保護(hù)。汞燈/氙燈的使用和保養(yǎng)。標(biāo)本熒光信號(hào)的保護(hù)。AF細(xì)胞觀察計(jì)數(shù)及結(jié)果分析100X油鏡下選擇探針雜交充分，不重疊的細(xì)胞計(jì)數(shù)50個(gè)陽(yáng)性：異常細(xì)胞比率占60%以上陰性：正常細(xì)胞比率占90%以上無(wú)法判斷：沒(méi)達(dá)到以上標(biāo)準(zhǔn)，可擴(kuò)大計(jì)數(shù)范圍HER-2細(xì)胞觀察計(jì)數(shù)及結(jié)果分析100X油鏡下浸潤(rùn)區(qū)隨機(jī)計(jì)數(shù)30個(gè)細(xì)胞，計(jì)算紅綠信號(hào)的比值（Ratio）陽(yáng)性（擴(kuò)增）：

I:Ratio>2.2

II：成簇?cái)U(kuò)增陰性：Ratio<1.8無(wú)法判斷：Ratio在1.8-2.2之間，分析更多細(xì)胞或重復(fù)實(shí)驗(yàn)HER-2基因擴(kuò)增模式肺癌細(xì)胞觀察計(jì)數(shù)及結(jié)果分析100X油鏡下癌區(qū)隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算紅綠信號(hào)的比值（Ratio）擴(kuò)增：I:

Ratio>2II:15copy>或=10%III:成簇?cái)U(kuò)增IV：Ratio<2但4copy>或=40%陰性：除以上擴(kuò)增的情況EGFR基因擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒（FISH）鏡下觀察可能現(xiàn)的問(wèn)題無(wú)熒光信號(hào)出沒(méi)有用酶進(jìn)行處理,用了不恰當(dāng)?shù)臑V光鏡沒(méi)有加入探針(或探針沒(méi)有經(jīng)過(guò)適當(dāng)變性),雜交條件不夠恰當(dāng)探針不合格(或探針沒(méi)有適當(dāng)保存),熒光顯微鏡沒(méi)有適當(dāng)?shù)仄鹱饔脽晒庑盘?hào)微弱雜交條件不夠充分探針過(guò)分稀釋造成濃度太低,沒(méi)有適當(dāng)變性,探針和雜交液沒(méi)有充分混合,洗滌條件不夠恰當(dāng)(或洗滌太過(guò)),濾光鏡不對(duì)有背景熒光雜交后洗滌不夠充分洗滌緩沖液鹽的濃度過(guò)高洗滌時(shí)溫度過(guò)低熒光信號(hào)計(jì)數(shù)問(wèn)題選擇分散較好不重疊的細(xì)胞計(jì)數(shù)IGH/CHER-2HER-2擴(kuò)增C-MYCCBFB基因斷裂重組檢測(cè)試劑盒探針：GLP

CBFBCBFB基因（Core

binding

factor

β，CBFB）：核心結(jié)合因子,位于16號(hào)染色體上。CBFB也是早期造血所必需的轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)與AML1的Runt同源結(jié)構(gòu)域結(jié)合，由AM