分離以尿素為氮源的微生物(上課)...ppt

1、實驗2 分離以尿素為氮源的微生物,此實驗課題意義何在？,1、尿素,尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、脲酶,土壤中的某些細菌能夠合成脲酶，并且向胞外分泌。,分離以尿素為氮源的微生物,怎么分離出能分解尿素的微生物呢？,菌種可能在什么環(huán)境中較多？,實驗室中微生物的篩選原理：,人為提供促進目的菌株生長的條件(包括 營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微 生物生長。,選擇性培養(yǎng)基,分離能夠分解尿素的選擇性培養(yǎng)基成分：,從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？,固體培養(yǎng)基,在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？,碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素,培養(yǎng)

2、基的氮源為尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長發(fā)育繁殖，而受到抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。,培養(yǎng)基選擇分解尿素的微生物的原理?,分離能夠分解尿素的選擇性培養(yǎng)基成分：,氮源真的唯一嗎？,1、瓊脂作為微生物固體培養(yǎng)基不可缺少的組成 成分，其優(yōu)點是： 其主要成分不能被微生物利用； 可使培養(yǎng)基固化； 不影響培養(yǎng)基中其他營養(yǎng)物質(zhì)被微生物吸收。 2、瓊脂的成分 瓊脂是一種未被純化的混合物，主要成分為瓊脂糖和瓊脂果膠，還含有少量的含氮化合物，及其它有機雜質(zhì)和不溶性雜質(zhì)。,用瓊脂糖代替瓊脂作為微生物培養(yǎng)基的固化劑.

3、 盡可能使培養(yǎng)基中只含尿素一種含氮化合 物，以防止瓊脂中的含氮化合物被以尿素為氮 源的細菌利用，有利于對這類細菌的篩選。,分離能夠分解尿素的選擇性培養(yǎng)基成分：,對培養(yǎng)基的滅菌方法？,G6玻璃砂漏斗過濾,怎樣證明此培養(yǎng)基具有選擇性呢？,以尿素為 唯一氮源 的培養(yǎng)基,牛肉膏 蛋白胨 培養(yǎng)基,是,分離 尿素 細菌,判斷該 培養(yǎng)基 有無選 擇性,只生長尿素細菌,生長多種微生物,是,選擇培養(yǎng)基,分離土壤中分解尿素的微生物并計數(shù),.篩選菌株,.分離出單個菌落并統(tǒng)計菌落數(shù)目,.設(shè)置對照,平板劃線法,稀釋涂布法,稀釋涂布平板法 原理： 將樣品進行稀釋，在稀釋度足夠高時， 微生物在固體培養(yǎng)基上能形成單個菌落。

4、所形成的一個菌落是由一個單細胞繁殖而成 的，即一個菌落代表原先的一個單細胞。,實驗的具體操作 .土壤取樣 從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先滅菌好的信封中。 取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。 .制備培養(yǎng)基： 制備以尿素為唯一氮源的選擇性培養(yǎng)基。 制備基礎(chǔ)培養(yǎng)基。,應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g。 在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進行,三樣品的稀釋,移液槍（微量可調(diào)移液管）,注意事項 為使結(jié)果接近真實值將同一稀釋度加到三個或三個以上的平皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計算出菌落平均數(shù)。 為了保證結(jié)果準確，一般選擇菌落數(shù)在30300的平板上進行計數(shù)。如

5、果得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進行菌落的計數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗不精確，需要重新實驗。 統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低。,分離不同的微生物采用不同的稀釋度,原因：不同微生物在土壤中含量不同,實驗中提供的選擇培養(yǎng)基的配方中，尿素是培養(yǎng)基中的惟一氮源，因此，原則上只有能夠利用尿素的微生物才能夠生長。但實際上，微生物的培養(yǎng)是一個非常復(fù)雜的問題，有些微生物可以利用其他微生物的代謝產(chǎn)物生長繁殖，因此能夠在選擇培養(yǎng)基上生長的微生物不一定是所需要的微生物，還需要進一步的驗證。,在實驗中，酚紅作為酸堿指示劑被添加到了培養(yǎng)基中

6、，其變色范圍是pH6.48.2，在酸性情況下呈黃色，堿性情況下呈紅色，這種添加了酸堿指示劑的培養(yǎng)既可以鑒別和分離出能夠產(chǎn)生脲酶分解尿素的微生物，稱為鑒別培養(yǎng)基。,尿素在被脲酶催化分解前是中性的，由于尿素在脲酶的催化下分解產(chǎn)生了NH3，溶液會呈堿性。,分離能夠分解尿素的選擇性培養(yǎng)基成分：,鑒別培養(yǎng)基,酚紅,選擇培養(yǎng)基,鑒別培養(yǎng)基,在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，培養(yǎng)基中將出現(xiàn)紅色環(huán)帶的菌落，說明該細菌能夠分解尿素。,測定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是將一定體積的水用細菌過濾器過濾后，將濾膜放到 伊紅美藍 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，大腸桿菌菌落呈現(xiàn)黑色，通過

7、記述得出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。,大腸桿菌呈 黑色中心 ,有或無金屬光澤,大腸桿菌在伊紅美藍瓊脂(EMB)上典型特征,顯微鏡直接計數(shù)：,利用血球計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容 積里樣品中微生物的數(shù)量。,顯微鏡直接計數(shù)：,不能區(qū)分死菌與活菌； 不適于對運動細菌的計數(shù)； 需要相對高的細菌濃度； 個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察；,缺點,設(shè)置對照的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度。,設(shè)置對照：,實例：在做分解尿素的細菌的篩選與統(tǒng)計菌 落數(shù)目的實驗時，A同學(xué)從對應(yīng)的106 倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個菌 落，但是其他同學(xué)在同樣的稀釋度下 只選擇出大約50個菌落。分

8、析其原因。,原因：土樣不同， 培養(yǎng)基污染或操作失誤 (或者是混入了其他的含氮物質(zhì)),小結(jié)：通過這個事例可以看出，實驗結(jié)果要有說服力，對照的設(shè)置是必不可少的。,方案一：由其他同學(xué)用與A同學(xué)相同土樣進行實驗,方案二：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。,結(jié)果預(yù)測：如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。,結(jié)果分析與評價 1.通過對照實驗，若培養(yǎng)物有雜菌污染，菌落數(shù)偏高；若培養(yǎng)物混入其他氮源，則菌落形態(tài)多樣，菌落數(shù)偏高，難以選擇出分解尿素的微生物。 2.提示：選擇每個平板上長有30300個菌落

9、的稀釋倍計算每克樣品的菌數(shù)最合適。同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌落數(shù)不能相差懸殊，如相差較大，表示實驗不精確。,六、例題解析,例1對細菌群體生長規(guī)律測定的正確的表述是 A在液體培養(yǎng)基上進行 B至少接種一種細菌 C接種一個細菌 D及時補充消耗的營養(yǎng)物質(zhì),解析：細菌群體生長規(guī)律的測定是人們在一定條件下進行的。這些條件是：一種細菌、恒定容積的培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基、定時測定細菌總數(shù)。在這些條件下，才能測定出細菌的生長規(guī)律。測定時只能用一種細菌的子細胞群體的變化規(guī)律表達微生物的生長；恒定容積是給微生物提供一定的生存環(huán)境；液體培養(yǎng)基才能通過樣品推測細菌總數(shù)。若接種多種細菌，則會發(fā)生種間斗爭而不能測定一種微生物的

10、生長規(guī)律。在接種時，要保證一定的接種量。,答案：A,例2在微生物群體生長規(guī)律的測定中，種內(nèi)斗爭最顯著最激烈的時期是 A調(diào)整期 B對數(shù)期 C穩(wěn)定期 D衰亡期,解析：種內(nèi)斗爭是一種生態(tài)因素。種內(nèi)斗爭反應(yīng)了種內(nèi)生物對生存空間和生活資源的爭奪。在生活空間充裕，營養(yǎng)充足的時候，種內(nèi)斗爭的程度是比較低的。隨著微生物個體數(shù)目的增加，每個個體的生存空間越來越少，營養(yǎng)物質(zhì)也越來越少，每個個體對生存空間和資源的爭奪也越來越激烈，種內(nèi)斗爭就越來越激烈。由此可知，在穩(wěn)定期的種內(nèi)斗爭最激烈。在衰亡期，微生物的數(shù)目已經(jīng)開始減少，pH已經(jīng)極度不適于微生物的生存，次級代謝產(chǎn)物積累到很高的程度，這時的微生物的生存斗爭主要是與無

11、機環(huán)境的斗爭。,答案：C,1.對細菌群體生長規(guī)律測定的正確的表述是（ ） A.在液體培養(yǎng)基上進行 B.至少接種一種細菌 C.接種一個細菌 D.及時補充消耗的營養(yǎng)物質(zhì) 2.使用選擇培養(yǎng)基的目的是（ ） A.培養(yǎng)細菌 B.培養(yǎng)真菌 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別 3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是( ) A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3 C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素,實踐訓(xùn)練,A,C,D,4.下列說法不正確的是（ ） A.科學(xué)家從7080度熱泉中分離到耐高溫的TaqDNA聚合酶 B.統(tǒng)計某一稀釋度的5個平板的菌落數(shù)依次為M1、M2、M3、M4、M5，以M3作為該樣品菌落數(shù)的估計值 C.設(shè)置對照實驗的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度 D.同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物數(shù)量最大，種類最多。 5.為培養(yǎng)和分離出酵母菌并淘汰雜菌，常在培養(yǎng)基中加入（ ） A.較多的氮源物質(zhì) B.較多的碳源物質(zhì) C.青霉素類藥物 D.高濃度食鹽,B,C,例3（2005年江蘇）抗生素作為治療細菌感染的藥物，其高效性和巨大的經(jīng)濟價值使抗生素工業(yè)經(jīng)久不衰。其中青霉素的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用具有劃時代的意義。 青霉素發(fā)酵產(chǎn)生青霉素。青霉菌的新陳代謝類型是 ， 青霉素