限制性核酸內切酶的命名和類型課件

1、第2章基因工程的酶學基礎，第1節(jié)限制性內切酶第2節(jié)脫氧核糖核酸連接酶第3節(jié)脫氧核糖核酸聚合酶和逆轉錄酶第4節(jié)脫氧核糖核酸修飾酶第5節(jié)核酸外切酶第6節(jié)單鏈核酸內切酶第7節(jié)核酸酶：一種蛋白酶，它能切割兩個相鄰核苷酸殘基之間的磷酸二酯鍵，從而導致核酸分子的多條核酸鏈的水解切割。基本概念及其生物學功能，特別是水解和斷裂核糖核酸分子、脫氧核糖核酸酶特別是水解和斷裂脫氧核糖核酸分子、脫氧核糖核酸酶非特異性酶、底物脫氧核糖核酸或核糖核酸、從核酸分子的末端一個接一個地降解核苷酸、從核酸分子內部調用核酸外切酶切斷磷酸二酯鍵并將其斷裂成小片段，稱為核酸內切酶。通過水解來破壞核酸分子的方式是：而基因工程的操作是在分

2、子水平上的操作，它依賴于一些酶(例如限制性內切酶、連接酶、DNA聚合酶等)。)作為手工切割、拼接和擴增基因的工具。所以這些酶被稱為“工具酶”。工具酶，1，限制性修飾系統(tǒng)2，限制性內切酶的命名和類型3，第二類限制性內切酶的基本特征4，影響限制性內切酶活性的因素5，限制性內切酶對DNA的消化第1節(jié)限制性內切酶，限制性內切酶是一種能夠識別雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列(4-8bp)并從中切割雙鏈DNA的內切酶，限制性內切酶概念，2。主要來源于原核生物的內切酶，即在核酸分子鏈上形成切口的酶。形成5-磷和3-羥基終端，自我保護，3。功能、細菌限制和改造系統(tǒng)(R/M系統(tǒng))，1。來源，任何生物都有抵御外來物

3、質進入的機制，大腸桿菌B，大腸桿菌K、噬菌體(K B)，EOP=10-4(限制)即所謂的宿主控制限制和修飾現象簡稱為(R/M系統(tǒng))。細菌的再生/再生系統(tǒng)類似于免疫系統(tǒng)，它能把自己的脫氧核糖核酸與外來的脫氧核糖核酸區(qū)分開來，并降解后者。宿主限制和修飾，大腸桿菌培養(yǎng)效率，EOP=1，限制性內切酶分解外來入侵細菌的DNA并將其切割成小片段。(1)限制，限制：實際上是限制酶降解外源DNA和維持宿主遺傳穩(wěn)定性的保護機制。細菌的DNA堿基受甲基化酶的甲基化修飾保護，不能被限制性酶識別和切割。(2)修飾)，Dam甲基化酶，GATC腺嘌呤N6位引入甲基，Dcm甲基化酶，CCAGG或CCGG序列在第二個C的C5

4、位引入甲基，修飾3360宿主細胞可通過甲基化識別自身的遺傳物質和外源遺傳物質。(3)限制與修飾系統(tǒng)相關的三個基因，hsd R:編碼限制性內切酶，hsd M:編碼限制性甲基化酶，hsd S:編碼限制性內切酶和甲基化酶的共表達。這些酶可以識別DNA分子上的特定位點，并切斷雙鏈DNA。這些酶基于特定的DNA分子位點進行甲基化，從而可以修飾DNA。其作用是配合上述兩種酶來識別特殊的作用位點。2。輸入的噬菌體在大腸桿菌宿主細胞K株和B株中長時間生長，1)宿主細胞甲基化酶特異性保護染色體DNA和噬菌體DNA，2)自身產生的核酸內切酶識別位點被阻斷(修飾)，以及1。大腸桿菌宿主細胞K株和B株有各自的限制和修

5、飾系統(tǒng)。限制和修飾的分子機制，3。當外來DNA入侵時，它被宿主限制性內切酶特異性降解。由于降解不完全，一些外源DNA分子在宿主細胞增殖過程中被宿主細胞甲基化酶修飾，盡管它們是外源性的，但并未被降解。5.當接受新宿主細菌的甲基化修飾時，它失去了原始宿主細菌的修飾標記，并失去了在原始宿主細胞中的生存力。在基因工程中，缺乏限制性的菌株應被用作受體。1.限制修改系統(tǒng)2。限制性內切酶的命名和類型。第二類限制性內切酶的基本特征。影響限制性酶活性的因素。限制酶對脫氧核糖核酸的消化。第一節(jié)限制性內切酶，命名系統(tǒng)由史密斯和拿但斯于1973年提出，命名原則如下：限制性內切酶的命名由三個字母組成，第一個字母為類名，

6、前兩個字母為種名，大腸桿菌用Eco表示；流感嗜血桿菌由欣代表。2.如果酶存在于一個特殊的菌株中，在基本名稱上加上菌株名稱的第一個字母。如果酶的編碼基因位于噬菌體(病毒)或質粒上，染色體外遺傳成分用大寫字母表示。例如，后：d株EcoR:耐藥r質粒；3.如果在一個特定的菌株中有幾種不同的限制和修復系統(tǒng)，羅馬字母被用來表示在該菌株中發(fā)現某些酶的順序。例如，在hind: d菌株中發(fā)現的第二種酶，4。除了上述名稱外，所有限制性酶都應標有系統(tǒng)名稱。限制性內切酶系統(tǒng)命名為R，甲基化酶命名為M。例如，R.Hind表示限制性內切酶M。Hind表示相應的甲基化酶。在實際應用中，R經常被忽略。eCOR 1，埃希氏菌

7、屬，大腸桿菌屬，種，Ry13，菌株，否。如果種的前兩個字母相同，其中一個可以使用種的第一個和第三個字母。目前，已經鑒定了四種不同類型的限制性內切酶。根據識別和切割特性、催化條件以及限制性內切酶是否具有修飾的酶活性，可將其分為三種類型：和。限制性內切酶的類型2。限制性內切酶的類型根據識別和切割特性、催化條件以及限制性內切酶是否具有修飾的酶活性，可分為三種類型：和。用于基因工程，注：SAM為腺苷甲硫氨酸，1968年由麥塞爾森和袁從大腸桿菌B株和K株中首次分離得到。(1)識別位點序列，EcoB:TGA(n)8 TGT EcoK:AAC(n)6 gtgc，限制性內切酶的基本特征，如EcoB和EcoK。

8、非甲基化修飾的特定序列。n:表示任何一種需要三磷酸腺苷、鎂和腺苷甲硫氨酸(S-腺苷甲硫氨酸)的核苷酸，(3)輔助因子，其在離特定識別位點約10001500 bp處隨機切割單鏈，不產生特定片段，并且?guī)缀鯖]有應用。識別位點，切割，1-1.5kb，(2)切割位點分離的第一種酶是Hind未甲基化雙鏈DNA上的特殊靶序列(主要是回文序列)，與DNA的來源無關。限制性內切酶的基本特征是：(1)識別位點序列，識別位點。切割雙鏈DNA。形成粘性端或鈍端。例如：(2)切割位點、甲、甲、乙、丙、丁、脫氧核糖核酸、脫氧核糖核酸反應需要三磷酸腺苷、鎂和腺苷蛋氨酸。ecop1:agacc，ecop15:cagcag，它

9、們在基因工程操作中用處不大。限制性內切酶類型的基本特征，限制性內切酶類型，一類新鑒定的限制性內切酶。只有堿基被甲基化、羥甲基化和葡萄糖羥甲基化的DNA序列被切割。除了EcoKMcrBC，識別序列尚未確定，也尚未應用。核酸限制性內切酶的類型和主要特征。限制-修改系統(tǒng)2。限制性內切酶的命名和類型。第二類限制性內切酶的基本特征。影響限制性內切酶活性的因素。限制性內切酶對脫氧核糖核酸的消化。第一節(jié)限制性內切酶，識別序列，識別序列中堿基的數量一般為4-6 bp，有些識別較長，大多數識別位點具有旋轉對稱性(回文結構)，還有少數識別位點。4bp HPA c CGG hae cc5b pava g gwcc

10、ecor CCW gg 6bp bammg gattc smaccc GGG 11bp bg1 gcc nnnn nggc 12bp bstx ccan ntgc，1。以一對核苷酸為中心軸，相同數目的左右核苷酸相互互補。2.如果這兩條DNA鏈以相同的方向閱讀(例如5 3)，它們的核苷酸序列是相同的。5GAA TTC3 3CTT AAG5，有兩個特點：回文序列：反向重復序列，雙鏈DNA包含兩個結構相同方向相反的序列，5GTNAC3 3CANTG5，限制性內切酶切割雙鏈DNA，水解磷酸二酯鍵中的3-酯鍵產生兩個末端，末端結構為5-P和3-OH，產生三個不同的切口。切割模式，與類型II核酸內切酶相關

11、的一些概念，內聚末端):具有單鏈末端結構，該結構具有由兩條DNA單鏈上的不同(對稱)消化位點形成的互補堿基，并且通過消化產生的兩個內聚末端可以通過配對互補堿基容易地重新連接。鈍端):是酶消化后形成的平端結構，因為酶消化位點在兩條DNA單鏈上是相同的，并且這一端不容易重新連接。1。5個突出端，2個。3個突出的末端，I)不同的DNA雙鏈，只要粘性末端是互補的，它們就可以連接。這比連接兩個平齊端容易得多。粘性末端的含義，方便連接，ii)相同的DNA分子的內部連接，其可以通過兩個相同的粘性末端連接成環(huán)狀分子。粘性末端可以通過DNA聚合酶變平成齊平的末端。而B 3的末端可以通過末端轉移酶加上幾個多核苷酸

12、(如dA和dT)的尾部，也就是說，均聚物的尾部會造成人工粘性末端。A 5的末端可以用32P的DNA多核苷酸激酶標記。結束標記，3。平端、平端、連接困難、連接效率低，只有粘接端連接效率的1%，這種連接經常出現多重連接。連接粘性端和沖洗端的處理方法。)補充方法：使用DNA聚合酶將堿基補充到目標基因的粘性末端。)修剪(展平)方法使用核酸酶如S1和Bal31來切斷靶基因粘性末端的單鏈突出部分，使其成為齊平末端。不同來源的酶識別相同的序列，并以相同或不同的方式切割。識別位點和切割點是相同的，如Hind和hsu 1，Hind 5-AAG CTT-33-TTC GAA-5hsu 1 5-AAG CTT-33

13、-TTC GAA-5，Isochizomer，完全Isochizomer:識別位點相同，但切割點不同。例如，圣誕一號和圣誕一號.不完全同溶酶：識別不同的序列，但能切掉相同的粘性末端。例如BamH I、Bgl、Bcl I、Xho等。5-ggatcc-3 3-cctagg-5，bamhi，bcl-1，5-tgatca-3 3-actagt-5，5-agatct-3 3-tctaga-5，bgl，5-ugatcy-3 Y代表嘧啶。等鏈體、5-GATC-33-CTAG-5、SAU3A和等鏈體粘性末端相互結合后形成的新位點不再能被原始酶識別。5-G 3-CCTAG、GATCT-3 A-5、BamH I、

14、Bgl、5-GGATCT-3、3-CCTAGA-5、BamH I、Bgl、Sau 3A、1。限制修改系統(tǒng)2。限制性內切酶的命名和類型。第二類限制性內切酶的基本特征。影響限制酶活性的因素。限制酶對脫氧核糖核酸的消化。第一節(jié)限制性內切酶1。標準酶水解體系的建立，限制性內切酶單位(u)的定義：在適當的溫度和緩沖液下，在20l反應體系中完成1g DNA酶水解所需的酶量。，建議：酶略過量(2-5倍)和反應時間較長，反應條件為限制性內切酶，2。酶解過程中，與酶解系統(tǒng)混合終止酶解結果的鑒定、酶解系統(tǒng)一般為20l，在酶溶液體積不超過總反應體積10%的前提下，盡可能減少總反應體積。裝載順序一般為：ddH2O緩沖

15、液DNA酶，大多數II型核酸內切酶需要類似的反應條件：，混合后，用微型高速離心機進行短期離心，使管壁上的所有液體下沉。反應通過三種方法終止：(1)加入乙二胺四乙酸至最終濃度為10摩爾/升；加入十二烷基硫酸鈉(SDS)至終濃度為0.1% (w/v)，在65加熱20min或70加熱10min)，用苯酚/氯仿萃取，鑒定酶解結果，用微瓊脂糖凝膠電泳快速觀察，然后決定是否終止反應。限制性內切酶的反應條件被完全消化：核酸內切酶的所有識別位點都被切割。局部消化：僅切除有限數量的消化部位。局部消化可以通過縮短培養(yǎng)時間、降低反應溫度或減少酶用量來實現。酶消化后，發(fā)現除了靶DNA帶外，還有其它帶，導致非特異性裂解；不正確的操作會導致其他核酸內切酶的污染；其他的DNA污染可能存在于底物DNA中。電泳后，電泳帶擴展，電泳帶移動距離異常，底物DNA不純；內切酶不純；酶蛋白本身或其他外源蛋白與DNA結合，使電泳帶異常移動。脫氧核糖核酸中的雜質，如蛋白質、多糖、苯酚、氯仿、乙醇、十二烷基硫酸鈉、乙二