限制性核酸內(nèi)切酶的命名和類型課件

1、第2章基因工程的酶學基礎(chǔ)，第1節(jié)限制性內(nèi)切酶第2節(jié)脫氧核糖核酸連接酶第3節(jié)脫氧核糖核酸聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶第4節(jié)脫氧核糖核酸修飾酶第5節(jié)核酸外切酶第6節(jié)單鏈核酸內(nèi)切酶第7節(jié)核酸酶：一種蛋白酶，它能切割兩個相鄰核苷酸殘基之間的磷酸二酯鍵，從而導(dǎo)致核酸分子的多條核酸鏈的水解切割。基本概念及其生物學功能，特別是水解和斷裂核糖核酸分子、脫氧核糖核酸酶特別是水解和斷裂脫氧核糖核酸分子、脫氧核糖核酸酶非特異性酶、底物脫氧核糖核酸或核糖核酸、從核酸分子的末端一個接一個地降解核苷酸、從核酸分子內(nèi)部調(diào)用核酸外切酶切斷磷酸二酯鍵并將其斷裂成小片段，稱為核酸內(nèi)切酶。通過水解來破壞核酸分子的方式是：而基因工程的操作是在分

2、子水平上的操作，它依賴于一些酶(例如限制性內(nèi)切酶、連接酶、DNA聚合酶等)。)作為手工切割、拼接和擴增基因的工具。所以這些酶被稱為“工具酶”。工具酶，1，限制性修飾系統(tǒng)2，限制性內(nèi)切酶的命名和類型3，第二類限制性內(nèi)切酶的基本特征4，影響限制性內(nèi)切酶活性的因素5，限制性內(nèi)切酶對DNA的消化第1節(jié)限制性內(nèi)切酶，限制性內(nèi)切酶是一種能夠識別雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列(4-8bp)并從中切割雙鏈DNA的內(nèi)切酶，限制性內(nèi)切酶概念，2。主要來源于原核生物的內(nèi)切酶，即在核酸分子鏈上形成切口的酶。形成5-磷和3-羥基終端，自我保護，3。功能、細菌限制和改造系統(tǒng)(R/M系統(tǒng))，1。來源，任何生物都有抵御外來物

3、質(zhì)進入的機制，大腸桿菌B，大腸桿菌K、噬菌體(K B)，EOP=10-4(限制)即所謂的宿主控制限制和修飾現(xiàn)象簡稱為(R/M系統(tǒng))。細菌的再生/再生系統(tǒng)類似于免疫系統(tǒng)，它能把自己的脫氧核糖核酸與外來的脫氧核糖核酸區(qū)分開來，并降解后者。宿主限制和修飾，大腸桿菌培養(yǎng)效率，EOP=1，限制性內(nèi)切酶分解外來入侵細菌的DNA并將其切割成小片段。(1)限制，限制：實際上是限制酶降解外源DNA和維持宿主遺傳穩(wěn)定性的保護機制。細菌的DNA堿基受甲基化酶的甲基化修飾保護，不能被限制性酶識別和切割。(2)修飾)，Dam甲基化酶，GATC腺嘌呤N6位引入甲基，Dcm甲基化酶，CCAGG或CCGG序列在第二個C的C5

4、位引入甲基，修飾3360宿主細胞可通過甲基化識別自身的遺傳物質(zhì)和外源遺傳物質(zhì)。(3)限制與修飾系統(tǒng)相關(guān)的三個基因，hsd R:編碼限制性內(nèi)切酶，hsd M:編碼限制性甲基化酶，hsd S:編碼限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的共表達。這些酶可以識別DNA分子上的特定位點，并切斷雙鏈DNA。這些酶基于特定的DNA分子位點進行甲基化，從而可以修飾DNA。其作用是配合上述兩種酶來識別特殊的作用位點。2。輸入的噬菌體在大腸桿菌宿主細胞K株和B株中長時間生長，1)宿主細胞甲基化酶特異性保護染色體DNA和噬菌體DNA，2)自身產(chǎn)生的核酸內(nèi)切酶識別位點被阻斷(修飾)，以及1。大腸桿菌宿主細胞K株和B株有各自的限制和修

5、飾系統(tǒng)。限制和修飾的分子機制，3。當外來DNA入侵時，它被宿主限制性內(nèi)切酶特異性降解。由于降解不完全，一些外源DNA分子在宿主細胞增殖過程中被宿主細胞甲基化酶修飾，盡管它們是外源性的，但并未被降解。5.當接受新宿主細菌的甲基化修飾時，它失去了原始宿主細菌的修飾標記，并失去了在原始宿主細胞中的生存力。在基因工程中，缺乏限制性的菌株應(yīng)被用作受體。1.限制修改系統(tǒng)2。限制性內(nèi)切酶的命名和類型。第二類限制性內(nèi)切酶的基本特征。影響限制性酶活性的因素。限制酶對脫氧核糖核酸的消化。第一節(jié)限制性內(nèi)切酶，命名系統(tǒng)由史密斯和拿但斯于1973年提出，命名原則如下：限制性內(nèi)切酶的命名由三個字母組成，第一個字母為類名，

6、前兩個字母為種名，大腸桿菌用Eco表示；流感嗜血桿菌由欣代表。2.如果酶存在于一個特殊的菌株中，在基本名稱上加上菌株名稱的第一個字母。如果酶的編碼基因位于噬菌體(病毒)或質(zhì)粒上，染色體外遺傳成分用大寫字母表示。例如，后：d株EcoR:耐藥r質(zhì)粒；3.如果在一個特定的菌株中有幾種不同的限制和修復(fù)系統(tǒng)，羅馬字母被用來表示在該菌株中發(fā)現(xiàn)某些酶的順序。例如，在hind: d菌株中發(fā)現(xiàn)的第二種酶，4。除了上述名稱外，所有限制性酶都應(yīng)標有系統(tǒng)名稱。限制性內(nèi)切酶系統(tǒng)命名為R，甲基化酶命名為M。例如，R.Hind表示限制性內(nèi)切酶M。Hind表示相應(yīng)的甲基化酶。在實際應(yīng)用中，R經(jīng)常被忽略。eCOR 1，埃希氏菌

7、屬，大腸桿菌屬，種，Ry13，菌株，否。如果種的前兩個字母相同，其中一個可以使用種的第一個和第三個字母。目前，已經(jīng)鑒定了四種不同類型的限制性內(nèi)切酶。根據(jù)識別和切割特性、催化條件以及限制性內(nèi)切酶是否具有修飾的酶活性，可將其分為三種類型：和。限制性內(nèi)切酶的類型2。限制性內(nèi)切酶的類型根據(jù)識別和切割特性、催化條件以及限制性內(nèi)切酶是否具有修飾的酶活性，可分為三種類型：和。用于基因工程，注：SAM為腺苷甲硫氨酸，1968年由麥塞爾森和袁從大腸桿菌B株和K株中首次分離得到。(1)識別位點序列，EcoB:TGA(n)8 TGT EcoK:AAC(n)6 gtgc，限制性內(nèi)切酶的基本特征，如EcoB和EcoK。

8、非甲基化修飾的特定序列。n:表示任何一種需要三磷酸腺苷、鎂和腺苷甲硫氨酸(S-腺苷甲硫氨酸)的核苷酸，(3)輔助因子，其在離特定識別位點約10001500 bp處隨機切割單鏈，不產(chǎn)生特定片段，并且?guī)缀鯖]有應(yīng)用。識別位點，切割，1-1.5kb，(2)切割位點分離的第一種酶是Hind未甲基化雙鏈DNA上的特殊靶序列(主要是回文序列)，與DNA的來源無關(guān)。限制性內(nèi)切酶的基本特征是：(1)識別位點序列，識別位點。切割雙鏈DNA。形成粘性端或鈍端。例如：(2)切割位點、甲、甲、乙、丙、丁、脫氧核糖核酸、脫氧核糖核酸反應(yīng)需要三磷酸腺苷、鎂和腺苷蛋氨酸。ecop1:agacc，ecop15:cagcag，它

9、們在基因工程操作中用處不大。限制性內(nèi)切酶類型的基本特征，限制性內(nèi)切酶類型，一類新鑒定的限制性內(nèi)切酶。只有堿基被甲基化、羥甲基化和葡萄糖羥甲基化的DNA序列被切割。除了EcoKMcrBC，識別序列尚未確定，也尚未應(yīng)用。核酸限制性內(nèi)切酶的類型和主要特征。限制-修改系統(tǒng)2。限制性內(nèi)切酶的命名和類型。第二類限制性內(nèi)切酶的基本特征。影響限制性內(nèi)切酶活性的因素。限制性內(nèi)切酶對脫氧核糖核酸的消化。第一節(jié)限制性內(nèi)切酶，識別序列，識別序列中堿基的數(shù)量一般為4-6 bp，有些識別較長，大多數(shù)識別位點具有旋轉(zhuǎn)對稱性(回文結(jié)構(gòu))，還有少數(shù)識別位點。4bp HPA c CGG hae cc5b pava g gwcc

10、ecor CCW gg 6bp bammg gattc smaccc GGG 11bp bg1 gcc nnnn nggc 12bp bstx ccan ntgc，1。以一對核苷酸為中心軸，相同數(shù)目的左右核苷酸相互互補。2.如果這兩條DNA鏈以相同的方向閱讀(例如5 3)，它們的核苷酸序列是相同的。5GAA TTC3 3CTT AAG5，有兩個特點：回文序列：反向重復(fù)序列，雙鏈DNA包含兩個結(jié)構(gòu)相同方向相反的序列，5GTNAC3 3CANTG5，限制性內(nèi)切酶切割雙鏈DNA，水解磷酸二酯鍵中的3-酯鍵產(chǎn)生兩個末端，末端結(jié)構(gòu)為5-P和3-OH，產(chǎn)生三個不同的切口。切割模式，與類型II核酸內(nèi)切酶相關(guān)

11、的一些概念，內(nèi)聚末端):具有單鏈末端結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)具有由兩條DNA單鏈上的不同(對稱)消化位點形成的互補堿基，并且通過消化產(chǎn)生的兩個內(nèi)聚末端可以通過配對互補堿基容易地重新連接。鈍端):是酶消化后形成的平端結(jié)構(gòu)，因為酶消化位點在兩條DNA單鏈上是相同的，并且這一端不容易重新連接。1。5個突出端，2個。3個突出的末端，I)不同的DNA雙鏈，只要粘性末端是互補的，它們就可以連接。這比連接兩個平齊端容易得多。粘性末端的含義，方便連接，ii)相同的DNA分子的內(nèi)部連接，其可以通過兩個相同的粘性末端連接成環(huán)狀分子。粘性末端可以通過DNA聚合酶變平成齊平的末端。而B 3的末端可以通過末端轉(zhuǎn)移酶加上幾個多核苷酸

12、(如dA和dT)的尾部，也就是說，均聚物的尾部會造成人工粘性末端。A 5的末端可以用32P的DNA多核苷酸激酶標記。結(jié)束標記，3。平端、平端、連接困難、連接效率低，只有粘接端連接效率的1%，這種連接經(jīng)常出現(xiàn)多重連接。連接粘性端和沖洗端的處理方法。)補充方法：使用DNA聚合酶將堿基補充到目標基因的粘性末端。)修剪(展平)方法使用核酸酶如S1和Bal31來切斷靶基因粘性末端的單鏈突出部分，使其成為齊平末端。不同來源的酶識別相同的序列，并以相同或不同的方式切割。識別位點和切割點是相同的，如Hind和hsu 1，Hind 5-AAG CTT-33-TTC GAA-5hsu 1 5-AAG CTT-33

13、-TTC GAA-5，Isochizomer，完全Isochizomer:識別位點相同，但切割點不同。例如，圣誕一號和圣誕一號.不完全同溶酶：識別不同的序列，但能切掉相同的粘性末端。例如BamH I、Bgl、Bcl I、Xho等。5-ggatcc-3 3-cctagg-5，bamhi，bcl-1，5-tgatca-3 3-actagt-5，5-agatct-3 3-tctaga-5，bgl，5-ugatcy-3 Y代表嘧啶。等鏈體、5-GATC-33-CTAG-5、SAU3A和等鏈體粘性末端相互結(jié)合后形成的新位點不再能被原始酶識別。5-G 3-CCTAG、GATCT-3 A-5、BamH I、

14、Bgl、5-GGATCT-3、3-CCTAGA-5、BamH I、Bgl、Sau 3A、1。限制修改系統(tǒng)2。限制性內(nèi)切酶的命名和類型。第二類限制性內(nèi)切酶的基本特征。影響限制酶活性的因素。限制酶對脫氧核糖核酸的消化。第一節(jié)限制性內(nèi)切酶1。標準酶水解體系的建立，限制性內(nèi)切酶單位(u)的定義：在適當?shù)臏囟群途彌_液下，在20l反應(yīng)體系中完成1g DNA酶水解所需的酶量。，建議：酶略過量(2-5倍)和反應(yīng)時間較長，反應(yīng)條件為限制性內(nèi)切酶，2。酶解過程中，與酶解系統(tǒng)混合終止酶解結(jié)果的鑒定、酶解系統(tǒng)一般為20l，在酶溶液體積不超過總反應(yīng)體積10%的前提下，盡可能減少總反應(yīng)體積。裝載順序一般為：ddH2O緩沖

15、液DNA酶，大多數(shù)II型核酸內(nèi)切酶需要類似的反應(yīng)條件：，混合后，用微型高速離心機進行短期離心，使管壁上的所有液體下沉。反應(yīng)通過三種方法終止：(1)加入乙二胺四乙酸至最終濃度為10摩爾/升；加入十二烷基硫酸鈉(SDS)至終濃度為0.1% (w/v)，在65加熱20min或70加熱10min)，用苯酚/氯仿萃取，鑒定酶解結(jié)果，用微瓊脂糖凝膠電泳快速觀察，然后決定是否終止反應(yīng)。限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)條件被完全消化：核酸內(nèi)切酶的所有識別位點都被切割。局部消化：僅切除有限數(shù)量的消化部位。局部消化可以通過縮短培養(yǎng)時間、降低反應(yīng)溫度或減少酶用量來實現(xiàn)。酶消化后，發(fā)現(xiàn)除了靶DNA帶外，還有其它帶，導(dǎo)致非特異性裂解；不正確的操作會導(dǎo)致其他核酸內(nèi)切酶的污染；其他的DNA污染可能存在于底物DNA中。電泳后，電泳帶擴展，電泳帶移動距離異常，底物DNA不純；內(nèi)切酶不純；酶蛋白本身或其他外源蛋白與DNA結(jié)合，使電泳帶異常移動。脫氧核糖核酸中的雜質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多糖、苯酚、氯仿、乙醇、十二烷基硫酸鈉、乙二