腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)技術(shù)ppt課件

1、、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)技術(shù)、首都醫(yī)科高等院校2015.11、片計(jì)程儀、一、概況二、細(xì)胞球劃痕實(shí)驗(yàn)三、Transwell四、裸鼠尾靜脈注射實(shí)驗(yàn)五、總結(jié)一、概況、二、細(xì)胞球劃痕實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞球劃痕實(shí)驗(yàn)是一種簡單檢測細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的方法，實(shí)驗(yàn)成本低實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)：1.在一定程度上模擬了體內(nèi)細(xì)胞球的遷移過程。 2 .適用于研究細(xì)胞球與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM )、細(xì)胞球與細(xì)胞球相互作用的細(xì)胞球遷移。 3 .與包括活生生的細(xì)胞球影像學(xué)的顯微鏡系統(tǒng)兼容，并且可用于分析細(xì)胞球之間的相互作用。 4 .研究細(xì)胞球遷移的體外實(shí)驗(yàn)中最簡單的方法。 二、細(xì)胞球齒輪離合器實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)材料：細(xì)胞球樣品儀器，易耗品： 6孔大板塊標(biāo)記直尺槍頭試劑，

2、試劑盒：無血清培養(yǎng)基，PBS，二，細(xì)胞球齒輪離合器實(shí)驗(yàn)，1 .可滅菌儀器均須滅菌2 .超潔凈工作臺(tái)紫外線消毒30min注：需滅菌器材為離心管，吸管移液槍，槍頭，二，細(xì)胞球齒輪離合器實(shí)驗(yàn)4 .每孔放入5X105個(gè)細(xì)胞球，約2.4時(shí)間的注：1.數(shù)可以通過晚上貼壁鋪滿，可以適當(dāng)調(diào)整。 數(shù)量少時(shí)，可以從一定時(shí)間培養(yǎng)到鋪滿板床。 (3. 6板床背面畫線5-6條)，2、細(xì)胞球損傷實(shí)驗(yàn)，用5.1ml槍口對板床和線垂直造成細(xì)胞球損傷，盡可能各損傷寬度一致注：用人造槍口制傷影響難以保證損傷寬度一致性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這也是該方法最大的缺陷，二、三6 .吸取舊培養(yǎng)基，用無菌PBS洗滌3次細(xì)胞球，除去提取的細(xì)胞球后，加入

3、無血清培養(yǎng)基，根據(jù)需要設(shè)置實(shí)驗(yàn)組、對照組。 注：清洗時(shí)輕柔、貼壁加入，不流單層細(xì)胞球，二、放入細(xì)胞球劃傷實(shí)驗(yàn)、7.37度5%CO2孵化機(jī)中培養(yǎng)。 0(6)、1.2、2.4時(shí)間采樣、拍攝攝影圖片。 image J軟件的計(jì)算、比較、各分析視野的齒輪離合器面積、二、細(xì)胞球齒輪離合器實(shí)驗(yàn)、新：德意志IBIDI技術(shù)、1 .細(xì)胞球的準(zhǔn)備、培養(yǎng)液、culture Insert。 在Dish之間的Insert中接種、培養(yǎng)細(xì)胞球。 3 .當(dāng)細(xì)胞球長度填滿插入?yún)^(qū)域時(shí)，用大頭針定徑套去除插入，會(huì)造成500m寬的傷痕。 4 .每隔46小時(shí)拍一次記錄。 5 .根據(jù)收集的圖像數(shù)據(jù)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了化學(xué)基分析，結(jié)果表明：二、

4、細(xì)胞球的齒輪離合器實(shí)驗(yàn)，闡述了幾個(gè)問題：1.細(xì)胞球的選擇：一般適用于上皮，纖維狀細(xì)胞系a .本身具有移動(dòng)能力，且較強(qiáng)。 b .有極性，易于測量、觀察。 c .對無血清有很強(qiáng)的忍耐力。 2 .觀察時(shí)間：一般為0，6，1.2，2.4時(shí)間a .時(shí)間長，無血清，易死亡，較強(qiáng)b .時(shí)間長，細(xì)胞球繁殖，假陽性，二，細(xì)胞球搔爬實(shí)驗(yàn)，三，Transwell，Transwell應(yīng)用Transwell細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞球共培養(yǎng)，細(xì)胞球趨化三、Transwell、Transwell池：常用8.0um膜、黏附130rmb、黏附40rmb，上層培養(yǎng)液：無血清培養(yǎng)基，為了維持滲透壓，應(yīng)添加0.05%-0.2% BSA細(xì)胞球：侵

5、襲性細(xì)胞球去血后充饑1224h 材料準(zhǔn)備和說明三、Transwell、基質(zhì)糊：底膜材料Matrigel的下層培養(yǎng)液：含有5% FBS的培養(yǎng)基，趨化因子細(xì)胞球培養(yǎng)板： 6孔，1.2孔，2.4孔等，在2.4孔中最常用，材料準(zhǔn)備和說明：三1 .用Transwell池制備涂層基底膜：用50mg/LMatrigel 1:8稀釋液涂層Transwell池底部膜的上室面，4風(fēng)干水化基底膜：吸引培養(yǎng)板中的剩馀液體，每孔含有50ul10g/lbsa的無血清三、Transwell、二.取細(xì)胞球混懸劑裝入Transwell單元，2.4小孔單元一般為200l。 一般在細(xì)胞球密度為110105個(gè)的. 3.24孔的下室中

6、裝入含有FBS和趨化因子的培養(yǎng)基500l。三、細(xì)胞球齒輪離合器實(shí)驗(yàn)，4 .培養(yǎng)細(xì)胞球：常規(guī)培養(yǎng)48h，具體調(diào)整，5 .結(jié)果測定：直接測定：細(xì)胞球染色，鏡下計(jì)數(shù)間接測定： MTT法，熒光試劑檢測，結(jié)晶紫染色，提問：某些藥物能抑制細(xì)胞球侵襲，抑制2.4時(shí)間后細(xì)胞球增殖，培養(yǎng)36h能看到結(jié)果嗎？ 三、Transwell，直接觀察：用棉棒拂拭基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞球染色：推薦0.1%結(jié)晶紫固定染色。 細(xì)胞球數(shù)：反復(fù)直接觀察細(xì)胞，或切開膜直接染色，取幾個(gè)視野來計(jì)算細(xì)胞球數(shù)。 三、Transwell，間接觀察：結(jié)晶紫法用棉棒拂拭基質(zhì)糨糊和上室內(nèi)的細(xì)胞球染色：推薦0.1%結(jié)晶紫固定染色。 染色后，以33%冰乙

7、酸脫色，可完全溶出結(jié)晶紫，洗脫劑以酶標(biāo)儀570nm測定ODD值，間接反映細(xì)胞球數(shù)。 四、裸鼠尾靜脈注射，小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移模型分類：1.人工轉(zhuǎn)移模型：注射腫瘤細(xì)胞球體外培養(yǎng)株和腹水等，并在肺(尾靜脈注射)、腦(頸動(dòng)脈注射)肝臟(肝動(dòng)脈注射)等處觀察2 .自發(fā)轉(zhuǎn)移模型：腫瘤細(xì)胞球接種小鼠腋下和腳丫子指皮下、腹腔肌和原組織，并觀察轉(zhuǎn)移灶四、裸鼠尾靜脈注射，1 .裸鼠選擇：4-6周裸鼠，價(jià)格約100 rmb 2.細(xì)胞球選擇：查閱文獻(xiàn)，選擇合適的細(xì)胞球株細(xì)胞球濃度：具體不定，動(dòng)物腫瘤一般接種2600萬100%的腫瘤，而人癌高1000萬以上裸鼠尾部靜脈注射，3 .注射技巧：固定： 50ml離心管自制或產(chǎn)品注射位置：小鼠尾部側(cè)面的2條靜脈，一般為尾部前端的1/3至1/2處插針。 注射：選用1-2ml注射器，針采用4號(hào)或4.5號(hào)。 靜脈的強(qiáng)調(diào)：溫水、燒燈等，四、裸鼠的尾靜脈注射，判斷是如何注射的：注射到靜脈的液體幾乎沒有抵抗，可以很快擠壓完液體的通常的600ul可以在1.0秒內(nèi)推一推。 靜脈以外注射，勉強(qiáng)推液阻力大，注射處周圍出現(xiàn)露水樣滲出液，出針后出血少。 另外，藥液淤