細(xì)胞培養(yǎng)(一)(1)

1、潘建平 教授浙大醫(yī)學(xué)部病原生物學(xué)系,細(xì)胞培養(yǎng)（一）,潘建平： 辦公室: 醫(yī)學(xué)院科研樓C801室 辦公室電話: 88206896 實(shí)驗(yàn)室：科研樓C805807室 Email: ,參考書,司徒鎮(zhèn)強(qiáng)、吳軍正. 細(xì)胞培養(yǎng). 世界圖書出版公司，2007 鄂征. 組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù). 北京出版社，2001 程寶鸞. 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù).中山大學(xué)出版社，2006,一、細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識(shí)二、細(xì)胞培養(yǎng)準(zhǔn)備技術(shù)三、細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)四、細(xì)胞培養(yǎng)的污染及控制五、細(xì)胞培養(yǎng)常見問題解答,組織（細(xì)胞）培養(yǎng)發(fā)展史年鑒,1878 Claude Bernard: 證明一個(gè)器官的生理系統(tǒng)在個(gè)體死亡以后仍然可以人工維持。 1885

2、 Wilhelm Roux: 在一個(gè)生理溶液中維持一塊雞胚的活性并觀察其發(fā)育，從而證實(shí)該發(fā)育與雞胚的其他部分無關(guān)。,1887 Ross Harrison: 利用凝固的青蛙淋巴液作為培養(yǎng)基，在體外培養(yǎng)青蛙神經(jīng)嵴，維持其活性達(dá)數(shù)星期，并觀察到了神經(jīng)纖維的生長，從而解決了神經(jīng)纖維的來源問題。Ross Harrison被人稱為細(xì)胞培養(yǎng)之父。,1910 Burrows: 率先在血漿凝塊中長期培養(yǎng)雞胚細(xì)胞。 1911 Lewis: 以海水、血清、胚胎提取物、鹽和蛋白胨為原料配制成了第一個(gè)人工的細(xì)胞培養(yǎng)液，并觀察到了單層細(xì)胞的有限生長。 1916 Rous & Jones: 開創(chuàng)用胰酶來收獲貼壁生長的細(xì)胞。

3、 1923-1931 Carrel: 研制T型培養(yǎng)瓶大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞。 1927 Carrel & Rivera: 制造了第一個(gè)病毒疫苗牛痘疫苗。,1933 Gey: 發(fā)明了轉(zhuǎn)管培養(yǎng)細(xì)胞的技術(shù)。 1948 Fisher: 研制成了第一個(gè)化學(xué)成分清楚的細(xì)胞培養(yǎng)液CMRL1006。 1952 Gey 和同事: 分離培養(yǎng)了HeLa細(xì)胞。 1952 Dulbecco: 發(fā)明了噬斑法，用長滿的單層細(xì)胞檢測病毒。,1954 Abercrombie: 觀察到了體外培養(yǎng)細(xì)胞接觸抑制的現(xiàn)象。 1961 Hatflick & Moorhead: 發(fā)現(xiàn)人成纖維細(xì)胞在一定的代數(shù)之后會(huì)死亡。 1965 Ham: 配制了第

4、一個(gè)無血清培養(yǎng)液。 1975 Khler & Milstein: 成功得到第一個(gè)用于單抗生產(chǎn)的雜交瘤細(xì)胞株。,一、細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)知識(shí)(一)細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念(二)細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用(三)體外培養(yǎng)細(xì)胞的種類(四)體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式及類型(五)體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長過程(六)體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長條件,細(xì)胞培養(yǎng) 將組織塊用機(jī)械或消化的方法分散成單個(gè)細(xì)胞，用培養(yǎng)基制成單個(gè)細(xì)胞懸液，在體外適宜條件下進(jìn)行培養(yǎng)生長。 細(xì)胞培養(yǎng)與組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)主要不同點(diǎn)： - 原始培養(yǎng)的對(duì)象不同 細(xì)胞培養(yǎng)：單個(gè)細(xì)胞懸液 組織培養(yǎng)：組織塊（0.51 mm3）或薄片（厚 0.2 mm） 器官培養(yǎng)：器官原基/器官的一部分/整個(gè)器官,

5、(一) 細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念,病毒學(xué)： 病毒分離培養(yǎng)及傳代；研究病毒細(xì)胞間相互作用；抗病毒藥物篩選 免疫學(xué)：單克隆抗體制備、免疫機(jī)制研究等 遺傳學(xué)：研究基因功能；染色體基因圖譜 生物醫(yī)學(xué)工程：蛋白表達(dá)、抗體工程；藥物安全性研究；生物相容性研究 分子細(xì)胞生物學(xué)：基因功能研究；細(xì)胞生物學(xué)行為研究 腫瘤學(xué),(二) 細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用,(三)體外培養(yǎng)細(xì)胞的種類,初代培養(yǎng)物/原代培養(yǎng)物 細(xì)胞系（cell line） 細(xì)胞株（cell strain）,初代培養(yǎng)物/原代培養(yǎng)物 即從供體取得的組織細(xì)胞在體外進(jìn)行培養(yǎng)后的首次培養(yǎng)物。 初代培養(yǎng)物一旦進(jìn)行傳代培養(yǎng)后，就成為細(xì)胞系。 （傳代培養(yǎng)：指將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)容器移植

6、到另一個(gè)培養(yǎng)容器中培養(yǎng)）,2. 細(xì)胞系（cell line） 初代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即成細(xì)胞系。包括： - 有限細(xì)胞系（finite cell line） 生存期有限的細(xì)胞系。不能繼續(xù)傳代或傳代數(shù)有限 - 連續(xù)細(xì)胞系或無限細(xì)胞系（infinite cell line）,獲無限繁殖能力能持續(xù)生存的細(xì)胞系。能連續(xù)傳代。 大多已發(fā)生異倍化，具異倍體核型，有的可能已成為惡性細(xì)胞，因此本質(zhì)上已是發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。 有的只有永生性，但仍保留接觸抑制和無異體接種致癌性。 有的既有永生性，又有異體接種致瘤性，說明已惡性化。,3. 細(xì)胞株（cell strain） 通過篩選或克隆化從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得

7、的具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞。這些特性（有一定的標(biāo)記染色體、特殊的抗原性等）在以后的培養(yǎng)中必須持續(xù)存在。包括： - 有限細(xì)胞株（finite cell line） 生存期有限的細(xì)胞株。不能繼續(xù)傳代或傳代數(shù)有限 - 連續(xù)細(xì)胞株或無限細(xì)胞株（infinite cell line） 已獲無限繁殖能力能持續(xù)生存的細(xì)胞株。能連續(xù)傳代。 亞株（substrain） 由原細(xì)胞株進(jìn)一步分離培養(yǎng)出與原株性狀不同的細(xì)胞群,二倍體細(xì)胞系或株 細(xì)胞群染色體數(shù)目具有與原供體二倍體細(xì)胞染色體數(shù)相同或基本相同（2n細(xì)胞占75以上）的細(xì)胞群。在正常情況下具有限生命期，屬有限細(xì)胞系。 隨供體年齡和組織來源的不同，壽命長短各異。

8、- 人胚肺成纖維細(xì)胞可傳4060代 - 人胚腎只有810代 - 人胚神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞1530代 為保持二倍體細(xì)胞能長期被利用，一般在初代或25代即大量凍存作為原種（stock cells），用時(shí)再進(jìn)行繁殖，用后再繼續(xù)凍存，可供長期使用或延緩細(xì)胞的衰老。 假二倍體：僅數(shù)目相同，而核型不同，即染色體形態(tài)有改變者。,遺傳缺陷細(xì)胞系或株 從有先天遺傳缺陷者取材（主要為成纖維細(xì)胞）培養(yǎng)的細(xì)胞，或用人工方法誘發(fā)突變的細(xì)胞，都屬遺傳缺陷細(xì)胞。這類細(xì)胞可能具有二倍體核型，也可呈異倍體。,腫瘤細(xì)胞系或株 是現(xiàn)有細(xì)胞系或細(xì)胞株中最多的一類，我國已建細(xì)胞系主要為這類細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞系由癌瘤建成，多呈類上皮型細(xì)胞，常已傳幾

9、十代或百代以上，并具有不死性和異體接種致瘤性。,細(xì)胞系或細(xì)胞株的命名,HeLa： 為供體患者的姓名（來源于宮頸癌）CHO： 中國倉鼠卵巢細(xì)胞（Chinese Hamster Ovary） 宮-743： 宮頸癌上皮細(xì)胞，1974年3月建立NIH3T3：美國國立衛(wèi)生研究院（National Institute of Health）建立；每3天傳代，每次接種3105 細(xì)胞毫升。,細(xì)胞系或株的鑒定、管理和使用,ATCC（American type culture collection）入庫細(xì)胞要求檢測項(xiàng)目如下：,培養(yǎng)簡歷：組織來源日期、物種、組織起源、性別、年齡、供體正?；虍惓＝】禒顟B(tài)、細(xì)胞已傳代數(shù)等

10、 凍存液：培養(yǎng)基和防凍液名稱 細(xì)胞活力：融解前后細(xì)胞接種存活率和生長特性 培養(yǎng)液：培養(yǎng)基種類和名稱（一般要求不含抗生素）、血清來源和含量,細(xì)胞形態(tài)：類型，如為上皮或成纖維細(xì)胞等，融解后細(xì)胞生長特性 核型：二倍體或多倍體，有無標(biāo)記染色體 無污染檢測：包括細(xì)菌、真菌、支原體、原蟲和病毒等 物種檢測：檢測同工酶，主要為G6PD和LDH，以證明細(xì)胞有否交叉污染以及反轉(zhuǎn)錄酶檢測 免疫檢測：一兩種血清學(xué)檢測 細(xì)胞建立者：建立者姓名，檢測者姓名,（四）體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式及類型,體外培養(yǎng)細(xì)胞大多培養(yǎng)在瓶皿等容器中，根據(jù)它們是否能貼附在支持物上生長的特性，可分為： - 貼附生長型 - 懸浮生長型,貼附生長型

11、,必須貼附于支持物表面才能生長。大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細(xì)胞。 判斷細(xì)胞形態(tài)時(shí)不能按照體內(nèi)組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn)判定，僅大致分成以下四型： 上皮細(xì)胞型 成纖維細(xì)胞型 游走細(xì)胞型 多型細(xì)胞型,1. 成纖維細(xì)胞型 胞體呈梭形或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)突起，生長時(shí)呈放射狀。除真正的成纖維細(xì)胞外，凡由中胚層間充質(zhì)起源的組織，如心肌、平滑肌、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮等常呈本型狀態(tài)。另外，凡培養(yǎng)中細(xì)胞的形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似時(shí)皆可稱之為成纖維細(xì)胞型。,名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似的 來源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織如：真正的成纖維 細(xì)胞、心肌、平滑肌、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮 形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細(xì)

12、胞的形態(tài)，胞體梭形或不規(guī)則 三角形，胞質(zhì)向外伸出23個(gè)長短不等的突起， 中有卵圓形核 生長特點(diǎn)：排列成放射狀，漩渦狀，并不緊靠連成片， 細(xì)胞細(xì)胞接觸易斷開而單獨(dú)行動(dòng)，游離的單獨(dú) 的成纖維樣細(xì)胞，常有幾個(gè)伸長的細(xì)胞突起,成纖維細(xì)胞,2. 上皮型細(xì)胞 細(xì)胞呈扁平不規(guī)則多角形，中央有圓形核，細(xì)胞彼此緊密相連成單層膜。生長時(shí)呈膜狀移動(dòng)，處于膜邊緣的細(xì)胞總與膜相連，很少單獨(dú)行動(dòng)。起源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝、胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。,名稱：僅形態(tài)上似體內(nèi)，實(shí)際上不完全相同 來源：來源于外胚層、內(nèi)胚層細(xì)胞, 如： 皮膚及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡, 上皮性腫瘤 形態(tài)：

13、類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞，扁平、不規(guī)則多角形，中有圓 形核 生長特點(diǎn)：易相連成片，相靠緊密相連成薄層鋪石狀 生長時(shí)呈膜狀移動(dòng)，很少脫離細(xì)胞群而單個(gè)活動(dòng),上皮型細(xì)胞,3.游走細(xì)胞型 來源于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的細(xì)胞，呈散在生長，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運(yùn)動(dòng)，方向不規(guī)則。此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有時(shí)難以和其他細(xì)胞相區(qū)別。 4.多型細(xì)胞型 有一些細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。,懸浮型 于懸浮狀態(tài)下即可生長，不需要貼附于支持物表面。見于少數(shù)特殊的細(xì)胞，如某些癌細(xì)胞和血液白細(xì)胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長。這類細(xì)胞容易大量繁殖。,概念：培養(yǎng)時(shí)不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長

14、 或以機(jī)械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長 來源：自血、脾或骨髓，尤其是血中白細(xì)胞、癌腫細(xì)胞 特點(diǎn)：在懸浮中生長良好細(xì)胞圓形，單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán) 優(yōu)點(diǎn)：生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便(不需消化)， 易于收獲，可獲得穩(wěn)定狀態(tài) 缺點(diǎn)：觀察不方便，很多細(xì)胞不能懸浮生長(尤其是正常 細(xì)胞),Hepatocytes,單個(gè)細(xì)胞生長過程：細(xì)胞周期 培養(yǎng)細(xì)胞一代生長過程：生長曲線 細(xì)胞系生長過程：培養(yǎng)細(xì)胞生命期,（五）體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長過程,1. 單個(gè)細(xì)胞的生長過程細(xì)胞周期（cell cycle）一個(gè)母細(xì)胞分裂結(jié)束后的細(xì)胞至其再分裂形成兩個(gè)子細(xì)胞的這段時(shí)期，可分為間期和M（分裂期）兩個(gè)階段。 間期：細(xì)胞完成生長過程，D

15、NA合成 DNA合成前期：G1期 DNA合成期：S期 DNA合成后期：G2期 M期：細(xì)胞有絲分裂期 細(xì)胞周期間期(G1 期+S 期+G2 期)+M 期，可簡稱之為GSM 周期。,細(xì)胞周期時(shí)間（time of cell cycle, Tc） 完成一次細(xì)胞周期所需要的時(shí)間 Tc的長短與物種的細(xì)胞類型有關(guān)，不同類型細(xì)胞的G1長短不同，是造成Tc差異的主要原因 測定Tc的方法 標(biāo)記有絲分裂百分率法（percentage labeled mitoses，PLM）,小鼠十二指腸上皮細(xì)胞 10小時(shí) 人類胃上皮細(xì)胞 24小時(shí)，骨髓細(xì)胞18小時(shí) 培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞 18小時(shí)，CHO細(xì)胞14小時(shí)，HeLa細(xì)胞21

16、小時(shí),標(biāo)記有絲分裂百分率法（percentage labeled mitoses，PLM）,原理：對(duì)測定細(xì)胞進(jìn)行脈沖標(biāo)記、定時(shí)取材、利用放射自顯影技術(shù)顯示標(biāo)記細(xì)胞，通過統(tǒng)計(jì)標(biāo)記有絲分裂細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的辦法來測定細(xì)胞周期。,待測細(xì)胞經(jīng)3H-TdR標(biāo)記后，所有S期細(xì)胞均被標(biāo)記。 S期細(xì)胞經(jīng)G2期才進(jìn)入M期，所以一段時(shí)間內(nèi)PLM=0。 開始出現(xiàn)標(biāo)記M期細(xì)胞時(shí)，表示處于S期最后階段的細(xì)胞，已渡過G2期，所以從PLM=0到出現(xiàn)PLM的時(shí)間間隔為TG2。,S期細(xì)胞逐漸進(jìn)入M期，PLM上升，到達(dá)到最高點(diǎn)的時(shí)候說明來自處于S最后階段的細(xì)胞，已完成M，進(jìn)入G1期。所以從開始出現(xiàn)M到PLM達(dá)到最高點(diǎn)（100%）的時(shí)間

17、間隔就是TM。 當(dāng)PLM開始下降時(shí)，表明處于S期最初階段的細(xì)胞也已進(jìn)入M期，所以出現(xiàn)PLM到PLM又開始下降的一段時(shí)間等于TS。 從PLM出現(xiàn)到下一次PLM出現(xiàn)的時(shí)間間隔就等于Tc，根據(jù)Tc=TG1+TS+TG2+TM即可求出的TG1長度。,事實(shí)上由于一個(gè)細(xì)胞群體中Tc和各時(shí)相不盡相同，第一個(gè)峰常達(dá)不到100%，以后的峰會(huì)發(fā)生衰減，PLM不一定會(huì)下降到零，所以實(shí)際測量時(shí)，常以（TG2+1/2TM）-TG2的方式求出TM。,細(xì)胞周期各階段的時(shí)間與PLM的關(guān)系,傳代：體內(nèi)細(xì)胞生長在動(dòng)態(tài)平衡環(huán)境中，而組織培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、皿或其它容器，生存空間和營養(yǎng)是有限的。當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，則需

18、要分離出一部分細(xì)胞和更新營養(yǎng)液，否則將影響細(xì)胞的繼續(xù)生存。,2. 培養(yǎng)細(xì)胞一代生長過程生長曲線,細(xì)胞“一代”：指培養(yǎng)細(xì)胞從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)時(shí)的一段時(shí)間，這已成為細(xì)胞培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說法，它與細(xì)胞倍增一代非同一含義。如某一細(xì)胞系為第153代細(xì)胞，即指該細(xì)胞系已傳代153次。它與細(xì)胞世代（generation）或倍增（doubling）不同；在細(xì)胞一代中，細(xì)胞能倍增36次。,培養(yǎng)細(xì)胞生長曲線,以貼附型細(xì)胞為例： （1）潛伏期（latent phase） 細(xì)胞接種培養(yǎng)后，先經(jīng)過一個(gè)在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。此時(shí)細(xì)胞胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。接著是細(xì)胞附著或貼附于底物表面上，稱貼壁，懸浮期結(jié)

19、束。貼附于支持物后的細(xì)胞，經(jīng)過一個(gè)潛伏階段，才進(jìn)入生長和增殖期。 各種細(xì)胞貼附速度不同，與細(xì)胞種類、培養(yǎng)基成分和底物理化性質(zhì)等密切相關(guān)。初代培養(yǎng)細(xì)胞貼附慢，可長達(dá)1024小時(shí)或更多；連續(xù)細(xì)胞系和惡性腫瘤細(xì)胞系貼附快，1030分鐘即可貼附。,細(xì)胞處在潛伏期時(shí)，可有運(yùn)動(dòng)，基本無增殖，少見分裂相。初代培養(yǎng)細(xì)胞潛伏期長，約2496小時(shí)或更長，連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞潛伏期短，僅624小時(shí)；細(xì)胞接種密度大時(shí)潛伏期短。 當(dāng)細(xì)胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時(shí)，標(biāo)志細(xì)胞已進(jìn)入對(duì)數(shù)增生期。,（2）對(duì)數(shù)增生期（logarithmic growth phase） 是細(xì)胞增殖最旺盛的階段，細(xì)胞分裂相增多。對(duì)數(shù)增生期細(xì)胞分裂相

20、數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長旺盛與否的一個(gè)重要標(biāo)志。 是細(xì)胞一代中活力最好的時(shí)期，因此是進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)最好的和最主要的階段。,接觸抑制 在接種細(xì)胞數(shù)量適宜情況下，對(duì)數(shù)增生期持續(xù)35天后，隨細(xì)胞數(shù)量不斷增多，生長空間漸趨減少，最后細(xì)胞相互接觸匯合成片。細(xì)胞相互接觸后，如培養(yǎng)的是正常細(xì)胞，由于細(xì)胞的相互接觸能抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，這種現(xiàn)象稱接觸抑制（contact inhibition）。 惡性細(xì)胞則無接觸抑制現(xiàn)象，因此接觸抑制可作為區(qū)別正常與癌細(xì)胞標(biāo)志之一。,密度抑制 細(xì)胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營養(yǎng)充分，細(xì)胞仍然能夠進(jìn)行增殖分裂，因此細(xì)胞數(shù)量仍在增多。但當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少

21、，代謝產(chǎn)物增多時(shí)，細(xì)胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制（density inhibition），導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。,判斷細(xì)胞生長的指標(biāo)： 對(duì)數(shù)生長期內(nèi)細(xì)胞分裂活動(dòng)的程度(增殖活性)可作為判斷細(xì)胞生長是否旺盛的重要指標(biāo) 有絲分裂指數(shù)(MI) 細(xì)胞群體倍增時(shí)間 細(xì)胞增殖活性測定： MTT法 標(biāo)記核苷酸(3H-TdR)摻入法,有絲分裂指數(shù)(MI),指培養(yǎng)物中分裂相數(shù)量占全部細(xì)胞數(shù)量的百分比，統(tǒng)計(jì)時(shí)，每瓶至少需計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞。 一般細(xì)胞的MI約為0.10.5%；原代培養(yǎng)物的MI比繼代培養(yǎng)物低。連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞高，可達(dá)3%5%。,操作步驟 消化細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接至內(nèi)含蓋玻片的培養(yǎng)皿中。

22、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，使細(xì)胞長在蓋片上。 取出蓋片，按下列順序操作： PBS漂洗3分鐘甲醇：冰醋酸=3：1固定液中固定30分鐘Giemsa液染色10分鐘自來水沖洗。 蓋片晾干后反扣在載玻片上，鏡檢。 計(jì)算： 分裂指數(shù)=分裂細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)100%,細(xì)胞群體倍增時(shí)間,培養(yǎng)物中細(xì)胞數(shù)量翻倍的平均時(shí)間 公式 TtLog2/Log(N/No) t：從接種到測細(xì)胞數(shù)的時(shí)間 N：時(shí)刻t測定的細(xì)胞數(shù) No：接種的細(xì)胞數(shù),MTT法,反映細(xì)胞內(nèi)一種酶活性程度 MTT為黃色化合物，是一種接受氫離子的染料，可作用于活細(xì)胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素C的作用下，生成藍(lán)色的formazan結(jié)晶，fo

23、rmazan結(jié)晶的生成量僅與活細(xì)胞數(shù)目成正比（死細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將MTT還原）。 還原生成的formazan結(jié)晶可在含50%的N，N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸鈉（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶標(biāo)儀測定570 nm處的光密度OD值，以反映出活細(xì)胞數(shù)目。也可以用DMSO來溶解。,標(biāo)記核苷酸(3H-TdR)摻入法：反映DNA,3H-TdR uptake (cpm),（3）停滯期（stagnate phase） 細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后，細(xì)胞遂停止增殖，進(jìn)入停滯期。此時(shí)細(xì)胞數(shù)量不再增加，故也稱平臺(tái)期（plateau）。停滯期細(xì)胞雖不增殖，但仍有代謝活動(dòng)，繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸

24、趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累、pH降低。 此時(shí)需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細(xì)胞會(huì)中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡，故傳代應(yīng)越早越好。傳代過晚（已有中毒跡象）能影響下一代細(xì)胞的機(jī)能狀態(tài)。在這種情況下，雖進(jìn)行了傳代，因細(xì)胞已受損，需要恢復(fù)，至少還要再傳12兩代，通過換液淘汰死細(xì)胞和使受損輕微的細(xì)胞得以恢復(fù)后，才能再用。,指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時(shí)間 人胚二倍體成纖維細(xì)胞培養(yǎng)，在不凍存和反復(fù)傳代條件下，可傳3050代，相當(dāng)于150300個(gè)細(xì)胞增殖周期，能維待一年左右的生存時(shí)間，最后衰老凋亡 如供體為成體或衰老個(gè)體，則生存時(shí)間較短；如培養(yǎng)的為其它細(xì)胞如肝細(xì)胞或腎細(xì)胞，生存時(shí)間更短，僅能傳幾代或十幾代

25、只有當(dāng)細(xì)胞發(fā)生遺傳性改變，如獲永生性或惡性轉(zhuǎn)化時(shí)，細(xì)胞的生存期才可能發(fā)生改變 正常細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，不論細(xì)胞的種類和供體的年齡如何，在細(xì)胞全生存過程中，大致經(jīng)歷以下三個(gè)階段：原代培養(yǎng)期、 傳代期、衰退期,3. 細(xì)胞系的生長過程培養(yǎng)細(xì)胞生命期,（1）原代培養(yǎng)期從體內(nèi)取出組織細(xì)胞接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)14周。此期細(xì)胞呈活躍的移動(dòng)，可見細(xì)胞分裂，但不旺盛。原代培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)上相似性大，多呈二倍體核型，是檢測藥物很好的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。 細(xì)胞群是異質(zhì)的，細(xì)胞相互依存性強(qiáng)。如把這種細(xì)胞群稀釋分散成單細(xì)胞，在軟瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞克隆形成率（cloning efficiency）很低，即細(xì)胞獨(dú)立生存性差?？寺⌒纬陕始醇?xì)胞群被稀釋分散成單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，形成細(xì)胞小群（克?。┑陌俜?jǐn)?shù)。,（2）傳代期初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱為細(xì)胞系。在全生命期中此期的持續(xù)時(shí)間最長。在培養(yǎng)條件較好情況下，細(xì)