酵母發(fā)酵法制備超氧化物歧化酶

1、酵母發(fā)酵法制備超氧化物歧化酶,sod的用途,sod 在食品工業(yè)中， 作為保健食品的功效因子或食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑， 該保健品具有良好的抗衰老、抗炎、抗輻射、抗疲勞等保健強(qiáng)身的效果。目前已有添加sod 的蛋黃醬、牛奶、可溶性咖啡、啤酒、白酒、果汁飲料、礦泉水、奶糖、酸牛乳、冷飲類等類型的保健食品面市。制成多種劑型的sod 或復(fù)合型食品。已有sod膠囊劑、片劑、口服液、脂質(zhì)體、顆粒劑等形式的sod 保健食品。 sod 可作為罐頭食品，果汁、啤酒等的抗氧劑， 防止過氧化物酶引起的食品變質(zhì)及腐敗現(xiàn)象。此外，還可作為水果、蔬菜的保鮮劑。 研究證實(shí)，sod 添加于化妝品中可起到四方面的作用： 一是有明顯的防曬效

2、果；二是sod 作為抗氧化酶能有效防止皮膚衰老、祛斑、抗皺；三是有明顯的抗炎效果，對防治皮膚病有一定效果；四是sod 具有一定的防治瘢痕形成的作用。,sod的使用現(xiàn)狀,自1969 年mccord 和fridovich 首次從牛紅細(xì)胞中分離出超氧化物歧化酶（sod）以來，人們相繼從牛、豬、羊、馬等動物紅細(xì)胞、肌肉、肝臟組織以及植物中分離和純化出sod。 國外已有多種藥用sod 應(yīng)用于臨床，主要集中在抗炎、抗輻射、抗腫瘤、抗衰老老及由超氧陰離子自由基引發(fā)疾病自身免疫性疾病等。目前，國內(nèi)sod 的應(yīng)用主要集中在食品和化妝品等方面，在吸收機(jī)制質(zhì)量穩(wěn)定性、有效性等方面的基礎(chǔ)研究取得一些新進(jìn)展。國內(nèi)現(xiàn)有s

3、od 產(chǎn)品主要是從牧畜血液中提取， 發(fā)酵法生產(chǎn)還未產(chǎn)業(yè)化。,sod性質(zhì),超氧化物歧化酶是廣泛存在于動物、植物及微生物細(xì)胞內(nèi)的金屬酶，至少可分為三種類型：cu，zn-sod、fe-sod、mn-sod。 該酶系一種酸性蛋白質(zhì)，較穩(wěn)定， 能耐熱。ph7.69 時(shí)穩(wěn)定，ph6 以下和12 以上不穩(wěn)定，ph2 以下極度不穩(wěn)定。具有較強(qiáng)的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶水解的能力。,工藝流程,工藝簡要介紹,發(fā)酸罐中發(fā)酵培養(yǎng)： 平皿上挑取取h2o2 性能好的單個(gè)菌落， 經(jīng)斜面培養(yǎng)、液體培養(yǎng)（一級）、擴(kuò)大培養(yǎng)（二級）后，按10%的量接入發(fā)酵罐（2l）中通氣培養(yǎng)。每隔2h 取樣一次， 于650mm 處測定發(fā)酵液的od 值

4、，當(dāng)od 值恒定而有下降趨勢時(shí)，放出發(fā)酵液，離心收集菌體供提取sod。 酵母菌中sod 的提取及純化：將離心分離得到的酵母菌體， 懸浮于緩沖液（50mm 磷酸鉀緩沖液，0.3m海藻糖，10m 氯化鎂，ph7.07.5）中，用蝸牛酶酶解后，超聲波破碎細(xì)胞壁， 菌體碎片再用dnase酶酶解，離心除去殘?jiān)?，得粗酶提取液；在攪拌下加入乙?氯仿（53）溶液，離心除去雜蛋白；再加入磷酸氫二鉀鹽析； 上清液加入0.75 倍冷丙酮，冷凍離心得粗酶沉淀； 將沉淀溶于ph7.8磷酸鉀（2.5mm）緩沖液中透析12d，即得cu，zn-sod 酶液。,個(gè)別試劑用途解釋,0.3m海藻糖：本來是0.5m的蔗糖的，但經(jīng)過

5、查找文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)不同濃度的海藻糖對sod 均有較強(qiáng)的保護(hù)作用，其中濃度在0.3mol/l 時(shí)效果最佳，而蔗糖對sod既無激活作用也沒抑制作用，所以改成了海藻糖。 dnase i：即deoxyribonuclease i，中文名稱為脫氧核糖核酸酶i，是一種可以消化單鏈或雙鏈dna產(chǎn)生單脫氧核苷酸或單鏈或雙鏈的寡脫氧核苷酸的核酸內(nèi)切酶。dnase i水解單鏈或雙鏈dna后的產(chǎn)物，5端為磷酸基團(tuán)，3端為羥基。 10m氯化鎂溶液：是dnase i激活劑。 dnase i活性依賴于鈣離子，并能被鎂離子或二價(jià)錳離子激活。鎂離子存在條件下，dnase i可隨機(jī)剪切雙鏈dna的任意位點(diǎn)。 蝸牛酶：是從蝸牛的嗦囊

6、和消化道中制備的混合酶，它含有纖維素酶，果膠酶，淀粉 酶，蛋白酶等20多種酶。蝸牛酶是很有價(jià)值的一種酶。它可以用于酵母細(xì)胞壁的破碎,sod酶活力測定,在一般情況下，sod活性測定只能應(yīng)用間接活性測定法。其測定方法很多，常見的有化學(xué)法、免疫法和等電點(diǎn)聚焦法。其中化學(xué)法應(yīng)用最普遍，化學(xué)法的原理主要是利用有些化合物在自氧化過程中會產(chǎn)生有色中間物和o2-，利用sod分解而間接推算酶活力。 在化學(xué)方法中，最常用的有黃嘌呤氧化酶法，鄰苯三酚法，化學(xué)發(fā)光法，腎上腺素法，nbt-還原法，光化學(xué)擴(kuò)增法，cyte還原法等。其中改良的鄰苯三酚自氧化法簡單易行較為實(shí)用。本實(shí)驗(yàn)采用鄰苯三酚自氧化方法。,鄰苯三酚自氧化法

7、原理,鄰苯三酚在堿性條件下，能迅速自氧化，釋放出o2- （超氧陰離子自由基），生成帶色的中間產(chǎn)物（紅桔酚），反應(yīng)開始后反應(yīng)液先變成黃棕色，幾分鐘后轉(zhuǎn)綠，幾小時(shí)后又轉(zhuǎn)變成黃色，這是因?yàn)樯傻闹虚g物不斷氧化的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)中測定的是鄰苯三酚自氧化過程中的初始階段，中間物的積累在滯留3045s后，與時(shí)間成線性關(guān)系，一般線性時(shí)間維持在4min的范圍內(nèi)，中間物在325nm波長出有強(qiáng)烈光吸收。當(dāng)有sod存在時(shí)，由于它能催化o2-與h+結(jié)合生成o2和h2o2，從而阻止了中間有色產(chǎn)物的積累，導(dǎo)致吸光值下降因此，通過測定它們在特定波長下得光吸收變化速率計(jì)算出sod的酶活性 。,鄰苯三酚 o2- + 紅桔酚 （自氧化：有色物質(zhì)積累，吸光值增加） o2- + o2- +2h+h202+o2 （sod催化：阻止中間產(chǎn)物積累，吸光值降低）,ph=8.2,sod,實(shí)驗(yàn)步驟,1測定鄰苯三酚溶液自氧化速率： 取兩支試管按右表加入25預(yù)熱過的緩沖液,然后加入預(yù)熱過的鄰苯三酚（空白管用10mmol/lhcl代替鄰苯三酚），迅速搖勻，立即傾入1cm比色杯中，在325nm波長處測定光吸收值，每隔30s讀數(shù)一次，測定4min內(nèi)每分鐘光吸收值的變化。要求自氧化速率控制在每分鐘的光吸收值為0.070（可增減鄰苯三酚的加入量，以控制光吸收值）。,2.sod樣液活力測定： 樣品管取代自氧化管。樣品管測定時(shí)先加入預(yù)熱的