實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)-ppt.ppt

1、,實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用 (Real time Quantitative PCR) 分子生物學(xué)技術(shù)平臺(tái) 江燕瓊,提綱：,實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理 數(shù)學(xué)原理 化學(xué)原理 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法應(yīng)用 絕對(duì)定量 相對(duì)定量 定量PCR的實(shí)驗(yàn)要素 平臺(tái)定量PCR儀器介紹,實(shí)時(shí)熒光定量PCR定義：,在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析的方法。,與普通PCR的區(qū)別,普通PCR技術(shù)： 在PCR結(jié)束后對(duì)終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。 實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)： 實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增，在擴(kuò)增的指數(shù)期對(duì)起 始模板進(jìn)行定量。,熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定

2、的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，一般熒光域值的設(shè)置是 基線（背景）熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍。 每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為 CT 值（ threshold value ）。,定量PCR的數(shù)學(xué)原理,斜率與擴(kuò)增效率,熒光定量PCR化學(xué)原理,非特異性熒光標(biāo)記： 1、SYBR Green 特異性熒光標(biāo)記： 2、TaqMan,1、SYBR Green 法,SYBR Green 熔解曲線分析,SYBR Green法優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn): 對(duì)DNA模板沒有選擇性 適用于任何DNA 使用方便-不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針 非常靈敏 便宜,2、TaqMan探針法,TaqMa

3、n作用機(jī)理,TaqMan法優(yōu)缺點(diǎn),Real-time PCR 方法應(yīng)用,絕對(duì)定量(Absolute Quantification，AQ) 病原體檢測(cè) 轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè) 基因表達(dá)研究 相對(duì)定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同組織中的表達(dá)差異 藥物療效考核 耐藥性研究,絕對(duì)定量與相對(duì)定量的定義,絕對(duì)定量通過標(biāo)準(zhǔn)品定量,絕對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)樣品： 已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒DNA，做系列稀釋。 標(biāo)準(zhǔn)樣品的種類： 含有和待測(cè)樣品相同擴(kuò)增片段的克隆質(zhì)粒 含有和待測(cè)樣品相同擴(kuò)增片段的cDNA PCR的產(chǎn)物,絕對(duì)定量：從熒光到拷貝數(shù),相對(duì)定量通過內(nèi)標(biāo)定量,內(nèi)標(biāo)（Endogenous Con

4、trol）通常是-actin、GAPDH基因等看家基因 在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響小 內(nèi)標(biāo)定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組數(shù)量,相對(duì)定量：參照因子Calibrator,相對(duì)定量分析方法1 -Ct,前提：目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴(kuò)增效率接近100且偏 差在 5以內(nèi) 1、用內(nèi)參基因的CT值歸一目標(biāo)基因的CT值： CT（test)= CT （target,test) - CT （ref,test) CT（calibrator)= CT （target, calibrator) - CT （ref, calibrator) 2、用校準(zhǔn)樣本的CT值歸一試驗(yàn)樣本的CT值： C

5、T= CT（test) - CT（calibrator) 3、計(jì)算表達(dá)水平比率： 2 CT=表達(dá)量的比值,相對(duì)定量分析方法2：雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法目標(biāo)基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增效率不同,待測(cè)樣品目的基因濃度 待測(cè)樣品內(nèi)參基因濃度 F= 對(duì)照樣品目的基因濃度 對(duì)照樣品內(nèi)參基因濃度,定量PCR的實(shí)驗(yàn)要素,樣品,DNA純度：OD260/OD280=1.8，1.6 2.0之間 DNA用量：0.05 ng 100 ng RNA純度：OD260/OD280=2.0 cDNA用量：1-100 ng 總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA取1 uL,標(biāo)準(zhǔn)品,標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋方法,復(fù)管測(cè)試 樣品和標(biāo)準(zhǔn)品都要重復(fù) 重復(fù)次數(shù)須遵循統(tǒng)計(jì)學(xué)要求,平臺(tái)PCR儀介紹,ABI 7500 fast,特征： 使用96孔板，樣品量大，儀器穩(wěn)定，結(jié)果分析直觀 ABI試劑ROX校正物理方面的誤差：槍的誤差（如試劑體積）、耗材質(zhì)量（如管蓋厚度、透光性能不一致）所導(dǎo)致的光能損失、儀器穩(wěn)定性（如孔間、批間溫度的波動(dòng)） Rn= Normalization = Reporter / Referenc,Rotor gene 6500HRM,特征： 36