預(yù)處理和菌體的破碎.ppt

1、第二章 預(yù)處理和細(xì)胞的破碎,2.1 固液分離的分類 2.2 發(fā)酵液的組成 2.3 懸浮液的預(yù)處理 預(yù)處理的目的 預(yù)處理方法 2.4 細(xì)胞破碎方法 2.5 細(xì)胞破碎理論 2.6 細(xì)胞破碎技術(shù) 2.7 細(xì)胞破碎方法的選擇及評(píng)價(jià),2.1 固液分離的類型,1、過濾: 重力過濾器、壓濾器、真空過濾器 2、離心 3、重力沉降 4、氣浮分離：在水中通入或設(shè)法使水體產(chǎn)生大量微細(xì)氣泡，附著于雜質(zhì)顆粒上，密度小于水而浮至水面，從而獲得分離的一種澄清方法。固液分離：處理固體顆粒粒度細(xì)小，很難用沉淀法分離。液液分離：用于從污水中分離回收石油，有機(jī)溶劑的微細(xì)油滴、表面活性劑及各種金屬離子。,2.3 懸浮液的預(yù)處理,凝聚

2、劑:指的是讓不穩(wěn)定的膠體微粒（或者凝結(jié)過程中形成的微粒）聚合在一起形成集合體的過程中所投加的藥劑的統(tǒng)稱。 種類：A、無機(jī)鹽類，如硫酸鋁、明礬、硫酸鐵、硫酸亞鐵、FeCl3、AlCl3、ZnCl、硫酸鎂等；B、無機(jī)堿，如Al(OH)3、Fe(OH)3、Ca(OH)2、CaO等；C、聚合無機(jī)鹽，如聚合鋁、聚合鐵。 機(jī)理：A、破壞雙電層，B、水解后膠體吸附，C、氫鍵結(jié)合等。 絮凝：在絮凝劑高分子聚合電解質(zhì)的作用下，膠體顆粒和聚合電解質(zhì)交連成網(wǎng)，形成10 mm大小的絮凝團(tuán)過程。絮凝劑種類：A、陽離子類，如聚丙烯酰胺(+)、聚苯烯酸二烷基胺乙酯、聚二烯丙基四胺；B、陰離子類，如聚丙烯酸納、聚苯乙烯磺酸、

3、聚丙烯酰胺(-)；C、非離子類，如聚丙烯酰胺(0)、環(huán)氧化乙烯。 機(jī)理：絮凝劑主要起中和電荷、橋架和網(wǎng)絡(luò)作用,細(xì)胞產(chǎn)物,2.4細(xì)胞破碎方法,細(xì)胞破碎物理法和化學(xué)法的比較,物理破碎法缺點(diǎn)： A、高能、高溫、高噪音、高剪切力(四高)，易使產(chǎn)品變性失活； B、非專一性，胞內(nèi)產(chǎn)物均釋放，分離純化困難； C、細(xì)胞碎片大小不一，難分離。 化學(xué)破碎法缺點(diǎn)： A、費(fèi)用高； B、引起新的污染，尤其是其他化學(xué)方法； C、一般只有有限的破碎，常需與其他物理法連用。,2.7 細(xì)胞破碎技術(shù),1)、固體剪切法(珠磨法, 最有效的物理破碎法) 操作簡介,2.7 細(xì)胞破碎技術(shù),計(jì)算 破碎遵循一級(jí)動(dòng)力學(xué)定律, 即 對(duì)上述方程積

4、分得 對(duì)于n次連續(xù)攪拌研磨操作，則得蛋白質(zhì)的物料平衡式 ：平均停留時(shí)間，V：磨腔的總體積，Q：發(fā)酵液的流量。,2.7 細(xì)胞破碎技術(shù),影響因素 a) 轉(zhuǎn)盤外緣速度(見下圖)： 適合條件：圓盤外緣速度 20 m/s, 一般在 5-15 m/s。 b) 珠粒添量和大小 添量：(見上圖，添量體積一般占總體積的80-90%) 粒徑：一般在0.2mm(實(shí)驗(yàn)室), 0.4 mm(工業(yè))。最終由實(shí)驗(yàn)確定,2.7 細(xì)胞破碎技術(shù),c) 溫度：溫度在5-40C范圍內(nèi)對(duì)破碎影響較小。但研磨產(chǎn)熱，功率 ，溫度 。如產(chǎn)物熱不穩(wěn)定，必須控溫。 d) 細(xì)胞濃度x：最佳x由實(shí)驗(yàn)確定。一般產(chǎn)熱量隨細(xì)胞濃度的降低而下降，但單位細(xì)胞

5、重量的能耗 。 e) 破碎效率： R：每kg成品細(xì)胞(如酵母)釋放的蛋白量，Q：物料流量，P：珠磨機(jī)消耗的功率。 f) 流量Q：破碎為一級(jí)反應(yīng)。,2.7 細(xì)胞破碎技術(shù),計(jì)算 服從一級(jí)反應(yīng)定律 式中，R為pro釋放量，Rm為pro最大釋放量. 影響因素 操作壓力p：p, R ;相反, R 。溫度 2C /10MPa 。 破碎次數(shù)N：N，R 。 溫度：比速度k與溫度有關(guān)，溫度25C，k1.5倍。 細(xì)胞抗破碎系數(shù)a：a酵母=2.9，a大腸桿菌 = 2.1。 細(xì)胞種類：影響k值。 細(xì)胞濃度： Z：常數(shù)，p0：破碎所需的最低壓力，：細(xì)胞濃度的參數(shù)。,2.7 細(xì)胞破碎技術(shù),閥門底座：刃緣閥座，平邊閥座 優(yōu)

6、點(diǎn) A、在大規(guī)模cell破碎中，高壓勻漿機(jī)和珠磨機(jī)用得最多; B、高壓勻漿機(jī)最適合于酵母和細(xì)菌; C、珠磨機(jī)可用于酵母和細(xì)菌，但對(duì)真菌菌絲和藻類更合適.,2.7 細(xì)胞破碎技術(shù),4) 超聲破碎法(1525kHz),2.7 細(xì)胞破碎技術(shù),機(jī)理 在超聲作用下產(chǎn)生的空穴化作用(cavitation)，空穴的形成和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力。 優(yōu)點(diǎn)：適合于多種細(xì)胞的破碎 缺點(diǎn)：A、影響因素多，如振幅、黏度、表面張力、液體體積和流速、探頭材料和形狀；B、超聲產(chǎn)生超氧離子毒害作用；C、有效能量的利用率低；D、產(chǎn)熱大，需控溫；E、不易放大，僅應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的細(xì)胞破碎。,2.7 細(xì)胞破碎技術(shù),5) 化學(xué)破碎

7、法 酶溶法、酸堿法、有機(jī)溶劑胞溶法、表面活性劑法 酶溶法：利用酶分解細(xì)胞壁上特出的化學(xué)鍵，使細(xì)胞壁破碎。 優(yōu)點(diǎn)： A、產(chǎn)品釋放的選擇性； B、提取速度和收效高； C、產(chǎn)品的破壞小； D、對(duì)外界環(huán)境，如pH和溫度等要求低； E、不殘留細(xì)胞碎片。,2.8 破碎方法的選擇,選擇的一般原則 A、提取產(chǎn)物在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，用機(jī)械法破碎 B、提取產(chǎn)物在細(xì)胞膜附近，用化學(xué)法 C、提取產(chǎn)物與細(xì)胞膜和細(xì)胞壁結(jié)合，可采用化學(xué)法和機(jī)械法結(jié)合的方法 破碎技術(shù)雜交研究應(yīng)注意的問題 A、雜交技術(shù)可產(chǎn)生很大優(yōu)勢(shì)。 B、破碎技術(shù)對(duì)下游分離技術(shù)的影響。破碎顆粒清除，產(chǎn)物的分離純化 C、在發(fā)酵階段，考慮到發(fā)酵過程和環(huán)境對(duì)破碎難易程度的

8、影響 D、菌種的培育，胞內(nèi)產(chǎn)物 胞外產(chǎn)物,2.8細(xì)胞破碎的評(píng)價(jià),破碎率定義 N0：原細(xì)胞數(shù)，N：破碎后殘存的正常細(xì)胞。N0和N的可通過直接計(jì)數(shù)和間接計(jì)數(shù)法得到。 直接計(jì)數(shù)法 方法：樣本稀釋 - 染色 - 上樣 計(jì)數(shù)。 計(jì)算：同上。 優(yōu)點(diǎn)：方法簡單。 缺點(diǎn)： A、計(jì)數(shù)時(shí)間長，B、只有活細(xì)胞才被計(jì)數(shù)，誤差大，C、細(xì)胞聚集時(shí)，不利計(jì)數(shù)，D、染色誤差。,2.8 細(xì)胞破碎的評(píng)價(jià),間接計(jì)數(shù)法 方法：樣本離心 - 取上清液 - 測(cè)特定蛋白質(zhì)或酶 - 與理論的最大值比較。 計(jì)算： Rm：理論最大值，R：實(shí)驗(yàn)測(cè)得值。 優(yōu)點(diǎn)：A、方法客觀可靠，尤其對(duì)蛋白質(zhì)和酶，B、有多種選擇的指標(biāo)，胞內(nèi)位置(如胞膜、胞壁、近胞膜

9、蛋白等)，靈活性大。 缺點(diǎn)：影響因素多，如溫度、pH值、剪切力、溶液的稀釋等。 解決辦法：篩選相對(duì)穩(wěn)定和恒定的指標(biāo)。,基因工程表達(dá)產(chǎn)物,存在的問題 A、包涵體 B、N-端多一個(gè)蛋氨酸殘基、表達(dá)產(chǎn)物未糖基化（大腸桿菌） C、表達(dá)產(chǎn)物過度糖基化，目標(biāo)產(chǎn)物變成抗原（酵母） D、大腸桿菌的內(nèi)毒素 包涵體的解決方法（一般步驟） A、包涵體的分離 B、包涵體溶解、變性、還原，一般用尿素、鹽酸胍、SDS C、蛋白質(zhì)的復(fù)性和重新氧化 D、一般的分離純化,習(xí)題,固液分離的類型:過濾(重力過濾器、壓濾器、真空過濾器);離心;重力沉降;氣懸浮 凝聚：在凝聚劑(如鋁鹽、鐵鹽、石灰和NaCl)作用下, 細(xì)胞蛋白質(zhì)等(準(zhǔn))膠體去穩(wěn)定，并聚集成1mm大小的凝聚塊的過程。 凝聚機(jī)理：A、破壞雙電層，B、水解后膠體吸附，C、氫鍵結(jié)合等。 絮凝：在絮凝劑高分子聚合電解質(zhì)的作用下，膠體顆粒和聚合電解質(zhì)交連成網(wǎng)，形成10 mm大小的絮凝團(tuán)過程。 氣浮分離：在水中通入或設(shè)法使水體產(chǎn)生大量微細(xì)氣泡，附著于雜質(zhì)顆粒上，密度小于水而浮至水面，從而獲得分離的一種澄清方法。