無菌檢查法（2010.12）PPT.ppt

1、無菌檢查法,2010.12,提綱,定義,定義,系指用于檢查藥典要求無菌的藥品、原料、輔料及其他品種是否無菌的一種方法。,的意義： 僅表明了供試品在該檢驗(yàn)條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。,檢查環(huán)境要求,無菌檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000級和局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進(jìn)行。 全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作。,常見檢驗(yàn)品種,注射劑 (水針、粉針、油乳注射劑） 眼用以及外傷用制劑（眼科手術(shù)、燒傷、嚴(yán)重創(chuàng)傷面給藥制劑） 無菌封裝的原料藥 醫(yī)療器具和醫(yī)用材料（可吸收的止血劑、外傷用脫脂棉、紗布、可被吸收的羊腸線及一次性注射器、博士倫等） 一般來說，凡直接進(jìn)入人體血液循環(huán)系統(tǒng)、肌肉、皮下組織、創(chuàng)傷、

2、潰瘍等部位而發(fā)生作用的制品都要進(jìn)行無菌檢查。,培養(yǎng)基,硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 3035 紅色氧化層（h深度的1/5） 100水浴加熱除去氧化層， 時間不超過20分鐘 滅菌后放置3天 沸水浴，10分鐘后 改良馬丁培養(yǎng)基 2328,無菌性檢查 每批培養(yǎng)基隨機(jī)取不少于5支（瓶）,培養(yǎng)14天,應(yīng)無菌生長。 靈敏度檢查 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 12ml，9支，4種菌，30 35 培養(yǎng)3天。 改良馬丁培養(yǎng)基 9ml，5支，2種菌（白色念珠菌、黑曲霉）， 23 25 培養(yǎng)5天。 結(jié)果判斷：空白管應(yīng)無菌生長,加菌管均生長良好。 菌液制備（100 cfu/ml 的菌懸液）,培養(yǎng)基的適用性檢查,靈敏度檢查,硫乙醇酸鹽

3、流體培養(yǎng)基靈敏度檢查試驗(yàn),生孢梭菌 銅綠假單胞菌 枯草芽孢桿菌 金黃色葡萄球菌,稀釋液以及沖洗液,0.1%蛋白胨水溶液 稀釋液 如果蛋白胨溶液渾濁，應(yīng)過濾 pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液 稀釋液 聚山梨酯80-0.1%蛋白胨水溶液 非水溶液制劑供試品的沖洗 十四烷酸異丙酯 膏劑和粘性油劑的溶劑 膜濾除菌,方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn),何時須進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證 當(dāng)供試品為新的產(chǎn)品時 當(dāng)供試品的組分、檢驗(yàn)條件發(fā)生改變時 驗(yàn)證用菌株：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉 菌種要求：不得超過5代 加菌量：100cfu 取樣量：只需確定總檢驗(yàn)量即可 檢查方法的選擇 薄膜過濾法 ：適用于

4、有抗菌作用或大容量的供試品，首選 直接接種法 ：適用于非抗菌作用的供試品,方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn),薄膜過濾法 取規(guī)定量供試品按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入小于100cfu的試驗(yàn)菌，過濾。取出濾膜接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基中，或?qū)⑴囵B(yǎng)基加至濾筒內(nèi)。另取一裝有同體積培養(yǎng)基的容器，加入等量試驗(yàn)菌，作為對照。置規(guī)定溫度培養(yǎng)35天。各試驗(yàn)菌同法操作。,方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn),直接接種法 取硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基8管，分別兩兩接入小于100cfu的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌；另取改良馬丁培養(yǎng)基4管，分別兩兩接入小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉。兩相同菌種管中，1

5、管接入規(guī)定量的供試品，另1管作為對照，置規(guī)定溫度培養(yǎng)35天。 培養(yǎng)基裝量要求 每個容器中接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基15ml/管 改良馬丁培養(yǎng)基10ml/管,方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn),結(jié)果判斷,若含供試品的任一容器中的試驗(yàn)菌生長微弱、緩慢或不生長，則該檢驗(yàn)條件下有抑菌作用， 應(yīng)采用增加沖洗量、增加培養(yǎng)基的用量、使用中和劑、更換濾膜品種等方法，消除抑菌作用，并重新驗(yàn)證。,與對照管比較,若含供試品各容器中的試驗(yàn)菌生長良好， 則該檢驗(yàn)條件下無抑菌作用或抑菌作用可忽略不計(jì)，照此檢查方法進(jìn)行供試品的無菌檢查；,供試品的無菌檢查,明確檢驗(yàn)數(shù)量與檢驗(yàn)量 檢驗(yàn)數(shù)量是指一次試驗(yàn)所用供試品

6、最小包裝容器的數(shù)量。 檢驗(yàn)量 是指一次試驗(yàn)所用的供試品總量（g 或ml）。 根據(jù)供試品的情況，確定檢樣數(shù)量 批出廠or上市抽檢；（出廠產(chǎn)品表1；上市產(chǎn)品表2、表3） 固體制劑or液體制劑；（液體表2；固體表3） 直接接種法or薄膜過濾法（薄膜過濾法應(yīng)增加1/2 的最小檢驗(yàn)數(shù)量作陽性對照用；直接接種法應(yīng)增加供試品無菌檢查時每個培養(yǎng)基接種的樣品量作陽性對照用） 參考藥典附錄79頁表1，表2，表3,供試品的無菌檢查,陽性對照 無抑菌作用及抗革蘭陽性菌為主的供試品 金黃色葡萄球菌為對照菌 抗革蘭陰性菌為主的供試品 大腸埃希菌為對照菌 抗厭氧菌的供試品 生孢梭菌為對照菌 抗真菌的供試品 白色念珠菌為對照

7、菌。 陰性對照 取相應(yīng)溶劑和稀釋液、沖洗液同法操作。,供試品的無菌檢查,供試品的處理及接種培養(yǎng)基 1、薄膜過濾法 1.1、水溶液供試品 取規(guī)定量，直接過濾或者配成溶液后過濾。如供試品具有抑菌作用或含防腐劑，須用沖洗液沖洗濾膜，所用的沖洗量、沖洗方法同方法驗(yàn)證試驗(yàn)。沖洗后，如用封閉式薄膜過濾器，分別將100ml 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基加入相應(yīng)的濾筒內(nèi)。如采用一般薄膜過濾器，取出濾膜，將其分成3 等份，分別置于含50ml 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基容器中，其中一份做陽性對照用。 1.2、可溶于水的固體制劑供試品 取規(guī)定量，加適宜的稀釋液溶解或按標(biāo)簽說明復(fù)溶，照1.1方法操作

8、。,供試品的無菌檢查,1.3、非水溶性制劑供試品 取規(guī)定量，直接過濾；或混合溶于含聚山梨酯80 或其他適宜乳化劑的稀釋液中，混勻，過濾。用含0.11%聚山梨酯80 的沖洗液沖洗濾膜至少3 次。濾膜于含或不含聚山梨酯80 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。接種培養(yǎng)基的方法照1.1操作。 1.4、可溶于十四烷酸異丙酯的膏劑和粘性油劑供試品 取規(guī)定量，混合至適量的無菌十四烷酸異丙酯中，溶解，過濾。對仍然無法過濾的供試品，于含有無菌十四烷酸異丙酯中的供試液中加入不少于100ml 的稀釋液，振搖萃取，靜置，取下層水相作為供試液過濾。過濾后濾膜沖洗及接種培養(yǎng)基照非水溶性制劑供試品項(xiàng)下的方法操作。,供試品的無菌檢查,2、直接

9、接種法 取規(guī)定量供試品分別接種至各含硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基的容器中。 2.1、固體制劑供試品 取規(guī)定量直接接種至各管培養(yǎng)基中?；蚣尤脒m宜的溶劑溶解，或按標(biāo)簽說明復(fù)溶后，取規(guī)定量接種至各管培養(yǎng)基中。 2.2、非水溶性制劑供試品 取規(guī)定量，混合，加入適量的聚山梨酯80 或其它適宜的乳化劑及稀釋劑使其乳化，接種至各管培養(yǎng)基中?；蛑苯咏臃N至含聚山梨酯80 或其它適宜乳化劑的各管培養(yǎng)基中。,供試品的無菌檢查,培養(yǎng)及觀察 細(xì)菌3035，霉菌2328培養(yǎng)14 天。14 天后，不能從外觀上判斷有無微生物生長，可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基中，細(xì)菌培養(yǎng)2天、真菌培養(yǎng)3天，觀察是否再出現(xiàn)渾濁；或取培養(yǎng)液涂片，染色