雙向電泳原理與流程.ppt

1、,萬 翔 X雙 向 電 泳 技 術(shù),Proteomics,“.the analysis of complete complement of proteins. Proteomics includes not only the identification and quantification of proteins, but also the determination of their localization, modifications, interactions, activities, and, ultimately, their function. Sta

2、nley Fields, University of Washington, Seattle, in Science 291, 1221 (2001),Proteomics,一個(gè)細(xì)胞在特定生理或病理狀態(tài)下表達(dá)的所有種類的蛋白質(zhì)稱為蛋白質(zhì)組(proteome) 僅僅從基因組學(xué)水平上無法徹底的了解各種生命現(xiàn)象, 因?yàn)榈鞍踪|(zhì)才是生命活動(dòng)的真正執(zhí)行者 從基因組學(xué)上我們無法檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯調(diào)節(jié)、選擇性剪切、以及蛋白復(fù)合物形成、蛋白質(zhì)相互作用等生命現(xiàn)象; 此外并不是細(xì)胞內(nèi)的所有的DNA都翻譯轉(zhuǎn)錄成蛋白質(zhì),Proteome Analysis and Proteomics,The analysis of

3、 the entire PROTEin complement expressed by a genOME, or by a cell or tissue type. Wasinger VC et al, Electrophoresis 16 (1995) “Proteomics is the study of quantitative changes of expression levels and their application to drug discovery, diagnostics and therapy.” Two basic technologies: 2-D electro

4、phoresis of complex protein mixtures Identification and structure analysis of proteins with mass spectrometry methods,Why 2DE?,Only “Proteomics” is the large-scale screening of the proteins of a cell, organism or biological fluid, a process which requires stringently controlled steps of sample prepa

5、ration, 2-D electrophoresis, image detection and analysis, spot identification, and database searches. The core technology of proteomics is 2-DE. At present, there is no other technique that is capable of simultaneously resolving thousands of proteins in one separation procedure.,理論 pI and Mr 圖 酵母細(xì)胞

6、表達(dá)6,216種蛋白,pI (理論值),Mr kDa,2DE 工作范圍,注: 圖片中沒有特別強(qiáng)調(diào)蛋白豐度和疏水性,至今1,484個(gè)蛋白被鑒定 (Nat.Biotechnol. 17,676 and 19, 242),From: Wildgruber et al. Electrophoresis 21 (2000) 2610-2616.,2D 電泳優(yōu)越性,對(duì)未處理樣本耐受性好 不需要預(yù)純化 (如：色譜層析) 分辨率非常高 2D 可以有效的組分收集器 蛋白在凝膠介質(zhì)中受到保護(hù) 在蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)中應(yīng)用范圍最廣（front-end ） 與其他技術(shù)相比，在一次試驗(yàn)中可檢測(cè)到的蛋白點(diǎn)更多 與后續(xù)分析技術(shù)兼

7、容性好 (如. MDLC),蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用舉例,研究細(xì)胞結(jié)果功能和分子組成,發(fā)現(xiàn)新的藥物靶位點(diǎn),發(fā)現(xiàn)新型生物學(xué)活性的分子和藥物,差異蛋白質(zhì)組學(xué),發(fā)現(xiàn)細(xì)菌、病毒感染和疾病監(jiān)測(cè)的分子標(biāo)志物,修飾蛋白質(zhì)組學(xué),遺傳或藥理學(xué)擾動(dòng)的分子解剖,病理生理學(xué)研究,中藥機(jī)理,相互作用蛋白質(zhì)組學(xué),研究藥物作用方式和毒性機(jī)理,植物抗蟲抗旱抗逆,遺傳育種和分子育種,資源環(huán)境,海洋生物,尋找差異蛋白質(zhì),環(huán)孢素A處理前,環(huán)孢素A處理后,正常 組織,腫瘤組織,細(xì)胞,組織,Life Sciences 的歷史,LKB 電泳發(fā)明者 Pharmacia 層析技術(shù)開創(chuàng)者 Amersham Biosciences 提供基因組、蛋白組學(xué)研

8、究整體解決方案 GE Healthcare Life Sciences 實(shí)現(xiàn)從發(fā)現(xiàn)到功能研究，從體外到體內(nèi)的突破,GE Healthcare milestones in 2-D electrophoresis,LKB introduced Ampholine, the first commercial carrier ampholyte,The first multiple separation system, ISO-DALT, was developed,Pharmacia Fine Chemicals introduced Pharmalyte,LKB introduced Immobi

9、line,Pharmacia Biotech introduced Immobiline DryStrip,Pharmacia Biotech introduced ImageMaster suite,Pharmacia Biotech introduced IPGphor,Pharmacia Biotech launched DALT II system,Amersham Pharmacia Biotech launched Typhoon,Amersham Biosciences launched Ettan DIGE,The Multiphor flatbed electrophores

10、is unit is launched. In production for 30 years in 2003!,Image analysis,Image acquisition,Automated spot picking,Spot digestion,MALDI target spotting,MALDI-ToF,Protein Separation,Proteomics 2DE Workflow,Sample Prep,Sample labeling,小鼠肝臟蛋白提取物2D凝膠電泳,2-D electrophoresis gel from Prof. Dr. A. Grg, Techni

11、cal University Munich, Germany,2D/MS 經(jīng)典工作流程,細(xì)胞裂解 勻漿 預(yù)分級(jí) 除雜質(zhì) 濃縮 定量,差異分析,雙向電泳 第一向 第二向,圖像獲取 圖譜分析,銀染 考染 熒光,蛋白標(biāo)記,樣品制備,分離,染色,圖譜分析,挖點(diǎn) 酶解 點(diǎn)靶,蛋白鑒定,體液,植物,微生物,組織,細(xì)胞,樣品制備,細(xì)胞破碎 蛋白沉淀 溶解 抑制蛋白酶活性 去除 核酸 脂類 鹽，緩沖液，離子性小分子 不溶性物質(zhì),2D/MS 經(jīng)典工作流程,差異分析,圖像獲取 圖譜分析,銀染 考染 熒光,蛋白標(biāo)記,染色,圖譜分析,挖點(diǎn) 酶解 點(diǎn)靶,蛋白鑒定,體液,植物,微生物,組織,細(xì)胞,Separation,雙

12、向電泳 第一向 第二向,細(xì)胞裂解 勻漿 預(yù)分級(jí) 除雜質(zhì) 濃縮 定量,樣品制備,Principle of 2-D Electrophoresis,1. First dimension:denaturing isoelectric focusingseparation according to the isoelectric point 2. Second dimension:SDS electrophoresisseparation according to the molecular weight,2-D electrophoresis resolves a few thousand prot

13、ein spots.,等電聚焦電泳原理,蛋白質(zhì)是帶有電荷的兩性生物大分子，其正負(fù)電荷的數(shù)量隨所處環(huán)境酸堿度的變化而變化。,等電聚焦（IEF）電泳就是在凝膠中加入兩性電解質(zhì)，從而構(gòu)成從正極到負(fù)極pH逐漸增加的pH梯度，處在其中的蛋白分子在電場(chǎng)的作用下運(yùn)動(dòng)，最后各自停留在其等電點(diǎn)的位置上，測(cè)出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等電點(diǎn)。,等電聚焦電泳原理,雙向電泳：傳統(tǒng)方法,使用載體兩性電解質(zhì)IEF時(shí)存在的問題,不同批次載體兩性電解質(zhì)的重現(xiàn)性 載體兩性電解質(zhì)梯度不穩(wěn)定 蛋白載量有限 重現(xiàn)性差導(dǎo)致梯度漂移 梯度漂移導(dǎo)致酸性和堿性蛋白質(zhì)丟失 管膠柔軟，尺寸不定 操作者個(gè)人技術(shù)影響結(jié)果,固相凝膠 (

14、支持膜上0.5 mm 厚凝膠),丙烯酰胺緩沖液: Immobiline CH2=CH-CO-NH-R, R ：羧基或叔胺基,固相 pH梯度 (IPG),Immobiline 干膠條的特性,可重復(fù)性 無梯度漂移, 真正的平衡方法 可分離酸性和堿性蛋白 容納蛋白樣本量更多 水平和垂直 SDS 凝膠中都能使用 允許樣本水化上樣 機(jī)械強(qiáng)度和尺寸穩(wěn)定 易操作 易于對(duì)樣本跟蹤標(biāo)記,新pH范圍的 Immobiline 干膠條,高分辨率的 IPG 膠條，聯(lián)合使用DeStreak試劑, 能改善極堿性區(qū)域蛋白點(diǎn)結(jié)果。歸功于獨(dú)特的試劑。 使用pH范圍相互重疊的干膠條，可提高2-D 圖譜 分析效率! 新pH范圍: I

15、mmobiline DryStrip pH 3 5.6 NL Immobiline DryStrip pH 5.3 6.5 Immobiline DryStrip pH 6.2 7.5 Immobiline DryStrip pH 7 11 NL Immobiline DryStrip pH 3 11 NL,不同pH范圍膠條,不同長度、多種窄pH范圍膠條可選，尤其是1個(gè)pH范圍 pH7-11NL堿性膠條,寬pH 、窄 pH 范圍膠條,寬pH梯度膠條應(yīng)用: 整個(gè)蛋白圖譜 窄 pH梯度膠條應(yīng)用: 提高分辨率 增加樣品上樣量 檢測(cè)分析更多蛋白,提高分辨率: 斑點(diǎn)顯現(xiàn),IPG 4-7,IPG 5-6,

16、IPG 4-7,IPG 5.5-6.7,Mouse liver proteins,From A. Grg et al. (1999),不同長度的膠條,7 cm 11 cm 13 cm 18 cm,24cm,線形與非線形膠條,for most samples Cell lysates Tissue extracts,linear (L),nonlinear (NL),for samples with abundant proteins in the range between pH 5 and 7 Serum proteins,pH 3-10 L and NL,from Prof. Angeli

17、ka Grg, Technical University Munich,Tissue Proteins from Mouse Liver,linear (L),nonlinear (NL),The IPGphor Platform,IPG 膠條 水化,IPG strip rehydration,如果水化時(shí)加入樣品， 此體積是加入樣品后的終體積,加樣品到膠條槽,泡漲盤 VS 聚焦盤,干膠條的水化,主動(dòng)水化：膠條槽內(nèi)進(jìn)行，大分子蛋白更容易進(jìn)入膠條；30120V，1024Hrs 被動(dòng)水化：專用水化盒中進(jìn)行NEW！ 無需覆蓋油！ 避免灰塵污染，空氣作用 不透明蓋子，適用于CyDye DIGE標(biāo)記 同時(shí)

18、適用于市場(chǎng)上所有724cm干膠條的水化,在樣品杯中加入少量不含樣品的水化液檢查是否漏液。上樣前吸走水化液。 上樣前將樣品離心去掉不溶物，每個(gè)樣品杯最多可加樣150l。 蓋上膠條槽的蓋子，再蓋IPGphor 儀器的蓋子。,分別將兩個(gè)IEF 電極片放在IPG 膠條膠的兩端，分別將電極壓在兩個(gè)電極片的外緣。 樣品杯可放在兩個(gè)電極間除膠條槽內(nèi)側(cè)凸起外任何位置，對(duì)于堿性分離范圍的IPG 膠條，盡量將樣品杯靠近陽極放置.,杯上樣 & 紙橋上樣,IEF電泳,IPGphor 包括半導(dǎo)體溫控系統(tǒng)(20C)和程序化電源(10000V) 可同時(shí)進(jìn)行12根膠條的等電聚焦 聚焦效果以“Vh”數(shù)控制，可提高重復(fù)性,IPG

19、 膠條的平衡兩步平衡,SDS 電泳前, 平衡母液: 2% SDS, 50mM Tris-HCl pH 8.8,6M urea, 30% glycerol + 蛋白與SDS結(jié)合 甘油和尿素降低電內(nèi)滲作用 第一步DTT平衡： (1 x 15min) 1% DTT 第二步碘乙酰胺平衡：去除多余的 DTT ，防止拖尾 (1 x 15min) 2.5% iodoacetamide,第二向垂直電泳系統(tǒng),瓊脂糖覆蓋密封,放置 IPG strip,低熔點(diǎn)瓊脂糖,Push the IPG Strip Down onto the Gel Surface,Seal the Cassette and Fix the

20、IPG Strip with Agarose,Inserting the Cassette,SDS-PAGE 參數(shù),SE600ruby,Ettan DALTsix,Ettan DALTtwelve system,第二向系統(tǒng),stripgelnumberrunning length (cm)size (cm)of gelstime (hr) Ettan Dalt1218, 2425 x 20124.5 Ettan Dalt618, 2425 x 20 64.5 SE 6002 x 7, 1314 x 16 (24) 44 MiniVE 78 x 7, 8 x10 21.5 Multiphor I

21、I7, 1124 x 11* 11.5 1824 x 18 13.3 PhastSystem (4)*4 x 4 20.5 * 2 or 3 strips side-by-side * cut or home-made strip,2D/MS 經(jīng)典工作流程,差異分析,圖像獲取 圖譜分析,蛋白標(biāo)記,圖譜分析,挖點(diǎn) 酶解 點(diǎn)靶,蛋白鑒定,體液,植物,微生物,組織,細(xì)胞,分離,細(xì)胞裂解 勻漿 預(yù)分級(jí) 除雜質(zhì) 濃縮 定量,樣品制備,雙向電泳 第一向 第二向,銀染 考染 熒光,染色,Protein Detection Methods,Coomassie Blue-考馬斯亮藍(lán)染色,+ 靈敏度 ，低至0.0

22、1 mg (“膠體”考染) + 非特異性染色 + 染料與蛋白成比例結(jié)合 + 線性化好 擴(kuò)散速度受限，膠的厚度影響跑膠速度 純度不夠 有限的動(dòng)力學(xué)范圍,膠體考馬斯亮藍(lán)染色,1 mg E. coli strain B IPGphor 24 cm pH 4 - 7 Colloidal CBBG250 staining,銀染,+ 靈敏度 ，低至0.2 ng + 在凝膠基質(zhì)中與蛋白交聯(lián) + 自動(dòng)催化反應(yīng) 染凝膠表面蛋白 線性化程度比考染低 一些大分子物質(zhì)也被染色 步驟多，某些步驟時(shí)間控制嚴(yán)格,Silver stained gel of E. coli Lysate,IPG 4-7 Silver stai

23、ned with PlusOneKit without glutaraldehyde and formaldehyde in the Ag sol.,2D/MS 經(jīng)典工作流程,差異分析,蛋白標(biāo)記,挖點(diǎn) 酶解 點(diǎn)靶,蛋白鑒定,體液,植物,微生物,組織,細(xì)胞,分離,細(xì)胞裂解 勻漿 預(yù)分級(jí) 除雜質(zhì) 濃縮 定量,樣品制備,雙向電泳 第一向 第二向,圖像獲取 圖譜分析,銀染 考染 熒光,染色,圖譜分析,ImageScanner III圖像掃描系統(tǒng),灰度校正功能 平臺(tái)具有防水功能，可直接掃描SDS-PAGE濕膠。 3.7OD高動(dòng)態(tài)范圍，保證高、低豐度蛋白的準(zhǔn)確定量。 掃描平臺(tái)大，A3掃描面積，一次可掃描2塊24cm凝膠。,Gray 256 scale Transmissive 300dpi,由SIB, GeneBio和GE Healthcare合作開發(fā)，為SwissProt推薦分析軟件。 高效能參數(shù)自動(dòng)找點(diǎn)，全自動(dòng)蛋白定量計(jì)算方法，不受背景影響。 在原始數(shù)據(jù)上進(jìn)行分析，結(jié)果可靠。界面窗口可隨意設(shè)計(jì)，界面極其友好。 全自動(dòng)凝膠匹配，采用先進(jìn)的算法。根據(jù)點(diǎn)的相關(guān)因素、形狀、位置、周圍情況，膠間匹配效率高。 多種統(tǒng)計(jì)學(xué)分析工具，快速找到膠間蛋白表達(dá)差異。 可直接鏈接到ExPASy 和 SwissProt 數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行網(wǎng)上檢索。 全部操作過程都可以