雙脫氧末端終止測(cè)序法原理過程和目標(biāo)基因cDNA序列拼接.ppt

1、雙脫氧末端終止法測(cè)序的原理、過程和目標(biāo)基因序列的分析,教 師：程 琳 2011 年 11 月,分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn),實(shí) 驗(yàn) 目 的,1、通過本實(shí)驗(yàn)了解雙脫氧鏈終止法的基本原理，掌握DNA測(cè)序的基本方法； 2、學(xué)會(huì)序列查詢、核酸及蛋白質(zhì)的同源性搜索和比對(duì)。,DNA測(cè)序技術(shù)主要有兩種方法，都是在20世紀(jì)70年代中期發(fā)明的。 A. 雙脫氧鏈終止法（the chain termination method），是通過合成與單鏈DNA互補(bǔ)的多核苷酸鏈來讀取待測(cè)DNA分子的順序。 B. 化學(xué)降解法（chemical degradation method），是將雙鏈DNA分子用化學(xué)試劑處理，產(chǎn)生切口，用同位素標(biāo)記進(jìn)

2、行測(cè)序。,一、DNA測(cè)序的方法,1. Sanger雙脫氧鏈終止法測(cè)序原理,利用DNA聚合酶和雙脫氧鏈終止物測(cè)定DNA核苷酸順序的方法，是由英國(guó)劍橋分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的生物化學(xué)家F. Sanger等人于1977年發(fā)明的。,基本原理： 聚丙烯酰胺凝膠電泳可以區(qū)分長(zhǎng)度只差一個(gè)核苷酸的DNA分子； 利用DNA聚合酶不能夠區(qū)分dNTP和ddNTP的特性，使ddNTP參入到寡核苷酸鏈的3-末端。因?yàn)閐dNTP 3不是-OH，不能與下一個(gè)核苷酸聚合延伸，從而終止DNA鏈的增長(zhǎng)。,2、具體操作：,測(cè)序時(shí)分成四個(gè)反應(yīng), 每個(gè)反應(yīng)除上述成分外分別加入2,3-雙脫氧的A, C, G, T核苷三磷酸（稱為ddATP,

3、ddCTP,ddGTP, ddTTP）, 然后進(jìn)行聚合反應(yīng)。在第一個(gè)反應(yīng)中, ddATP會(huì)隨機(jī)地代替dATP參加反應(yīng)，一旦ddATP加入了新合成的DNA鏈，由于其第3位的-OH變成了-H, 所以不能繼續(xù)延伸,于是第一個(gè)反應(yīng)中所產(chǎn)生的DNA鏈都是到A就終止了。,同理第二個(gè)反應(yīng)產(chǎn)生的都是以C結(jié)尾的; 第三個(gè)反應(yīng)的都以G結(jié)尾, 第四個(gè)反應(yīng)的都以T結(jié)尾, 電泳后就可以讀出序列了.,假如有一個(gè)DNA, 互補(bǔ)序列是GATCCGAT, 我們?cè)囍鲆幌?,在第一個(gè)反應(yīng)中由于含有dNTP + ddATP, 所以遇到G, T, C三個(gè)堿基時(shí)沒什么問題, 但遇到A時(shí), 摻入的可能是dATP或ddATP, 比如已合成

4、到G, 下一個(gè)如果參與反應(yīng)的是ddATP則終止, 產(chǎn)生一個(gè)僅有2個(gè)核苷酸的序列: GA, 否則繼續(xù)延伸, 可以產(chǎn)生序列GATCCG, 又到了下一個(gè)A了. 同樣有兩種情況, 如果是ddATP摻入, 則產(chǎn)生的序列是GATCCGA, 延伸終止, 否則可以繼續(xù)延伸, 產(chǎn)生GATCCGAT.,將得到如下結(jié)果：,制得的四組混合物全部平行地點(diǎn)加在變性聚丙烯酸受凝膠電泳板上進(jìn)行電泳，每組制品中的各個(gè)組分將按其鏈長(zhǎng)的不同得到分離，從而制得相應(yīng)的放射性自顯影圖譜。從所得圖譜即可直接讀得DNA的堿基序列。,即可得到測(cè)序結(jié)果：為GATCCGAT,制備單鏈模板 將單鏈模板與一小段引物退火 加入DNA多聚酶4種脫氧核苷酸

5、 分別加入少量4種雙脫氧核苷酸 將4種反應(yīng)產(chǎn)物分別在4條泳道電泳 根據(jù)4個(gè)堿基在4條泳道的終止位置讀出基因序列,3、技術(shù)路線：,4、 高通量自動(dòng)化測(cè)序,DNA 序列分析自動(dòng)化包括兩個(gè)方面的內(nèi)容，一方面是指“分析反應(yīng)”的自動(dòng)化，另一方面是指“讀片過程”的自動(dòng)化。 自動(dòng)化的DNA 序列分析，也是根據(jù)Sanger 雙脫氧鏈終止DNA測(cè)序法的基本原理發(fā)展起來的。,自動(dòng)化測(cè)序原理,自動(dòng)化測(cè)序類似于PCR反應(yīng)，但只用一條引物，反應(yīng)混合物中含有不同熒光標(biāo)記的ddNTP與4種dNTP。由于每種ddNTP帶有各自特定的熒光顏色,而簡(jiǎn)化為由1個(gè)泳道同時(shí)判讀4種堿基。產(chǎn)物條帶經(jīng)過檢測(cè)儀時(shí)給出特定信號(hào)，由計(jì)算機(jī)判讀并

6、記錄。 優(yōu)點(diǎn) ：可用雙鏈DNA做模板； 模板用量少，不必克??；可實(shí)現(xiàn)高通量自動(dòng)化。,高速自動(dòng)DNA測(cè)序儀的結(jié)構(gòu)及工作原理,由激光發(fā)射器產(chǎn)生的激光束，通過精密的光學(xué)系統(tǒng)后被導(dǎo)向凝膠表面的檢測(cè)區(qū)。在此，激光束垂直射向凝膠，同經(jīng)過檢測(cè)孔的DNA片段發(fā)生作用，并提供能量激發(fā)熒光發(fā)色基團(tuán)發(fā)射出具特異性波長(zhǎng)的熒光。這些熒光通過聚焦鏡集中后傳給濾光鏡/棱鏡組件，以便四種堿基產(chǎn)生的不同標(biāo)記波長(zhǎng)區(qū)別開來。經(jīng)成像透像最后由高靈敏度的相機(jī)分段收集信號(hào)，傳送給計(jì)算所分析處理。,熒光化合物標(biāo)記鏈終止法以熒光顏色為標(biāo)記信號(hào)，每種ddNTP各有1種代表顏色；整個(gè)反應(yīng)在一個(gè)試管中進(jìn)行；當(dāng)新合成的終止單鏈通過熒光監(jiān)測(cè)儀時(shí)，可由

7、光信號(hào)讀出末端核苷酸并由電腦記錄。,Sanger雙脫氧鏈終止DNA測(cè)序法的測(cè)序能力： 手工測(cè)序：最大約300 bp； 自動(dòng)測(cè)序：最大約1200 bp。,二、序列比對(duì)分析,1. 相似性與同源性 相似性(similarity)： 是指一種很直接的數(shù)量關(guān)系，比如部分相同或相似的百分比或其它一些合適的度量。比如說，A序列和B序列的相似性是80，或者4/5。這是個(gè)量化的關(guān)系。當(dāng)然可進(jìn)行自身局部比較。,同源性(homology)： 指從一些數(shù)據(jù)中推斷出的兩個(gè)基因或蛋白質(zhì)序列具而共同祖先的結(jié)論，屬于質(zhì)的判斷。就是說A和B的關(guān)系上，只有是同源序列，或者非同源序列兩種關(guān)系。而說A和B的同源性為80都是不科學(xué)的。

8、,序列的相似性和序列的同源性有一定的關(guān)系，一般來說序列間的相似性越高的話，它們是同源序列的可能性就更高，所以經(jīng)?？梢酝ㄟ^序列的相似性來推測(cè)序列是否同源。 正因?yàn)榇嬖谶@樣的關(guān)系，很多時(shí)候?qū)π蛄械南嗨菩院屯葱跃蜎]有做很明顯的區(qū)分，造成經(jīng)常等價(jià)混用兩個(gè)名詞。所以有出現(xiàn)A序列和B序列的同源性為80一說。,序列相似性比較： 就是將待研究序列與DNA或蛋白質(zhì)序列庫(kù)進(jìn)行比較，用于確定該序列的生物屬性，也就是找出與此序列相似的已知序列是什么。完成這一工作只需要使用兩兩序列比較算法。常用的程序包有BLAST、FASTA等；,序列同源性分析： 是將待研究序列加入到一組與之同源，但來自不同物種的序列中進(jìn)行多序列同

9、時(shí)比較，以確定該序列與其它序列間的同源性大小。這是理論分析方法中最關(guān)鍵的一步。完成這一工作必須使用多序列比較算法。常用的程序包有CLUSTAL等；,2. Blast簡(jiǎn)介及應(yīng)用,（1）Blast簡(jiǎn)介 BLAST 是由美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）開發(fā)的一個(gè)基于序列相似性的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索程序。 BLAST是“局部相似性基本查詢工 具”（Basic Local Alignment Search Tool）的縮寫。,Blast 是一個(gè)序列相似性搜索的程序包，其中包含了很多個(gè)獨(dú)立的程序，這些程序是根據(jù)查詢的對(duì)象和數(shù)據(jù)庫(kù)的不同來定義的。比如說查詢的序列為核酸，查詢數(shù)據(jù)庫(kù)亦為核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)，那么就應(yīng)該選擇

10、blastn程序。 下表列出了主要的blast程序：,主要的blast程序,（2） Blast資源,1、NCBI主站點(diǎn)： /BLAST/（網(wǎng)絡(luò)版） /blast/ （單機(jī)版） 2、其他站點(diǎn)： http:/nema.cap.ed.ac.uk/ncbi_blast.html /blast/（果蠅） ,Blast結(jié)果會(huì)列出跟查詢序列相似性比較高，符合限定要求的序列結(jié)果，根據(jù)這些結(jié)果可以獲取以下一些信息： 1.查詢序列可能具有某種功能； 2.查詢序列可能是來

11、源于某個(gè)物種； 3.查詢序列可能是某種功能基因的同源基因； 這些信息都可以應(yīng)用到后續(xù)分析中。,（3）Blast應(yīng)用,Blast任務(wù)提交表單1,1.序列信息部分,填入查詢（query）的序列,序列范圍 （默認(rèn)全部）,選擇搜索數(shù)據(jù)庫(kù),如果接受其他參數(shù)默認(rèn)設(shè)置，點(diǎn)擊開始搜索,Blast任務(wù)提交表單2,提交任務(wù),結(jié)果頁(yè)面1,圖形示意結(jié)果,結(jié)果頁(yè)面2,結(jié)果頁(yè)面3,詳細(xì)的比對(duì)上的序列的排列情況,（4）一個(gè)例子,假設(shè)以下為一未知蛋白序列 query_seq MSDNGPQSNQRSAPRITFGGPTDSTDNNQNGGRNGARPKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEELRFPRGQGVPIN

12、TNSGPDDQIGYYRRATRRVRGGDGKMKELSPRWYFYYLGTGPEASLPYGANKEGIVWVATEGALNTPKDHIGTRNPNNNAATVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRGNSRNSTPGSSRGNSPARMASGGGETALALLLLDRLNQLESKVSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKQYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQDLIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYHGAIKLDDKDPQFKDNVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKTDEAQPLPQRQKKQPTVTLLPAADMDDFSRQLQNSMSGASADST QA 我們通過blast搜索來獲取一些這個(gè)序列的信息。,具體步驟：,1.登陸blast主頁(yè) /BLAST/ 2.根據(jù)數(shù)據(jù)類型，選擇合適的程序 3.填寫表單信息 4.提交任