第二十一章-藥物制劑的微生物學(xué)檢查.ppt

1、第20章藥物制劑的微生物學(xué)檢查，藥物制劑的微生物學(xué)檢查主要包括無菌檢查、細(xì)菌總數(shù)檢查、霉菌總數(shù)檢查、病原菌檢查和螨蟲檢查等。 不同制劑的微生物學(xué)檢查要求完全不同。 第一節(jié)無菌制劑無菌檢查、無菌檢查是檢查藥物制劑中是否存在活著的微生物的一種方法。 各種注射液(如注射劑、輸液)、手術(shù)及眼科制劑必須保證不含有活微生物才能被視為合格。 否則，在臨床使用時會導(dǎo)致不良后果。 一、無菌檢查的基本原則、基本原則：采用嚴(yán)格的無菌操作方法，將檢測的藥品各接種一定量的適合各種微生物生長的不同培養(yǎng)基(通常是好氧菌培養(yǎng)基、厭氧菌培養(yǎng)基和真菌培養(yǎng)基)，在適當(dāng)?shù)臏囟认屡囵B(yǎng)一定時間后，觀察有無微生物生長，判斷被檢藥品的合格與

2、否。 無菌檢查采用部分采樣結(jié)果估計整體菌含情況，被檢樣品的采樣及程序必須符合國家藥典標(biāo)準(zhǔn)。 二、無菌檢查的基本方法；(一)一般藥品的無菌檢查一般藥品的無菌檢查采用直接接種法，即將檢驗品按規(guī)定量直接接種到適合好氧菌、厭氧菌和真菌生長繁殖的一定量的培養(yǎng)基中，同時在相同的培養(yǎng)基中進(jìn)行陽性對照試驗。 陽性對照實驗證明微生物能夠在實際應(yīng)用的實驗條件下生長。 中國藥典采用金黃色葡萄球CMCC(B)26003、孢霉CMCC(B)64941、白念珠菌CMCC(F)98001作為好氧菌、厭氧菌和真菌的陽性對照株。 然后根據(jù)需要培養(yǎng)一定時間，好氧菌、厭氧菌在30-35培養(yǎng)5天，真菌在20-25培養(yǎng)7天。 在觀察結(jié)

3、果時，陽性對照必須為長菌，才能判定檢驗品合格。 如果陽性對照管不是長菌，該藥物可能具有抗菌作用，或有油劑等特殊制劑。 如果檢驗品是液體，可以直接放入培養(yǎng)基的固體藥物，按規(guī)定加入一定量的無菌生理鹽水或無菌水，使藥物溶解在均勻的檢驗品溶液中，進(jìn)行無菌檢驗。 (二)特殊藥品的無菌檢查，如果陽性對照相管沒有細(xì)菌，必須進(jìn)行特殊處理。 1、油類藥物無菌檢驗一般油劑與普通培養(yǎng)基不混合，藥品中微生物難以生長，一般可采用吐溫培養(yǎng)基，其僥幸與普通藥品無菌檢驗法相同。 吐溫培養(yǎng)基的特征是培養(yǎng)基中的吐溫80使油類藥物均勻分散，增加培養(yǎng)基的機(jī)會，使微生物的檢測變得容易。 2、對含有抗菌藥物或防腐劑的藥物的檢查，如果被檢

4、藥物具有抗菌作用，則陽性對照管和試管都可能不產(chǎn)生菌，在進(jìn)行無菌檢查之前，必須在去除藥物自身的抗菌作用之后進(jìn)行無菌檢查。 (1)加入滅活劑或?qū)ο麆?，去除或抵消抗菌藥物的抗菌作用?但滅活劑本身對微生物無毒性，同時滅活劑與抗菌藥相互作用后的產(chǎn)物對微生物也無毒性，滅活劑的作用必須迅速完整。 例如青霉素在進(jìn)行無菌檢查時加入使青霉素失活的無菌青霉素酶溶液。(2)微孔過濾法被檢藥品加入無菌生理鹽水進(jìn)行稀釋，然后用無菌微孔過濾器(孔徑0.22-0.45m )過濾，用無菌生理鹽水充分清洗后，取出過濾器，分多片放入各種培養(yǎng)基中進(jìn)行檢查(4)離心沉淀法采取規(guī)定量的供試液拋棄清夜，保留底部濃縮菌液2ml左右，再稀釋

5、一定量進(jìn)行檢查，即限制內(nèi)服藥及外用藥的微生物總數(shù)和限制病原微生物種類的系列測定項目，我國規(guī)定項目有：細(xì)菌總數(shù)的測定、霉菌總數(shù)的測定、病原菌(大腸菌、金黃色葡萄球菌、綠膿菌、沙門氏菌) 判斷合格與否的標(biāo)準(zhǔn)是，口服藥和外用藥中的微生物總量必須低于規(guī)定限量，口服藥每克或每毫升必須含大腸桿菌、沙門氏菌。 外用藥每克或每毫升不含銅綠假單細(xì)胞菌、金黃色葡萄球菌和破傷風(fēng)桿菌。 也不能檢測出生螨。 另一方面，細(xì)菌總數(shù)的測定，了解被檢藥品的單位重量或體積(每克或毫升)內(nèi)含有的活菌數(shù)(實際上是好氧菌的活菌數(shù))，判斷供試劑被細(xì)菌污染的程度，是該藥品生產(chǎn)過程整體衛(wèi)生學(xué)綜合評價的重要依據(jù)。 測定方法采用瓊脂板計數(shù)法，將

6、一定量的供試劑用無菌生理鹽水按比例系數(shù)稀釋，將定量的稀釋液放入無菌板中，再加入一定量的融化溫度35左右的瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行攪拌，凝固后，培養(yǎng)37個小時，計數(shù)板內(nèi)的菌落。 一般選擇菌落數(shù)為30-300的平板進(jìn)行計數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)，可以得到每克或每毫升的活菌總數(shù)。 二、霉菌和酵母菌總數(shù)的測定，考察供試劑中每克或每毫升含有的生霉菌和酵母菌總數(shù)，查明檢驗品被真菌污染的程度。 測定方法與細(xì)菌總數(shù)的測定方法一樣，采用適于霉菌生長的虎紅培養(yǎng)基。 用25-28培養(yǎng)72小時，平皿生長的菌落數(shù)在5-50個的范圍是適當(dāng)?shù)?，可以乘以稀釋倍?shù)，得到每單位重量(或體積)的真菌總數(shù)。 三、病原菌檢查、病原菌檢查原則：病原菌形態(tài)

7、和培養(yǎng)特征觀察是鑒別的基本要求，生化反應(yīng)、血清學(xué)反應(yīng)、動物毒力試驗等項目要求因菌而異。 常規(guī)檢驗程序包括藥物準(zhǔn)備、預(yù)處理增菌培養(yǎng)分離培養(yǎng)純培養(yǎng)染色鏡檢驗、生化試驗、血清學(xué)試驗、動物試驗等結(jié)果判斷。 5種病原菌的鑒別意義和檢驗要點，1、大腸桿菌是口服藥品的常規(guī)必要檢驗項目。 藥品的這種菌來源于人和溫血動物的糞便。 從檢查品中檢出該菌，表明藥品有可能被糞便污染，患者服用后，有感染腸道病原菌和寄生蟲的危險。 因此，不能從口服藥品中檢測出大腸桿菌。 檢驗要點： (1)形態(tài)：革蘭陰性短小無芽胞桿菌(2)分離培養(yǎng)：在伊紅美蘭(EMB )培養(yǎng)基中分解乳糖，產(chǎn)生紫黑色、金屬光澤菌落。 (3)生化反應(yīng)：乳糖發(fā)酵

8、試驗：產(chǎn)酸產(chǎn)氣劑或產(chǎn)酸產(chǎn)氣劑IMVIC試驗：-。 2、沙門氏菌、口服藥物的必要檢查項目，它主要寄生在人體和動物的腸道內(nèi)，隨糞便可污染水源、食品和藥品，如傷寒、副傷寒、急性胃腸炎和敗血癥等人類疾病。 因此，內(nèi)服藥規(guī)定不能檢測沙門氏菌。 檢查要點： (1)形態(tài)革蘭陰性短桿菌(2)分離培養(yǎng)： SS瓊脂上沙門菌不分解乳糖，產(chǎn)生H2S，菌落無色透明或半透明，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤，菌落中心呈黑褐色。EMB平板上的菌落呈無色或粉紅色。 三糖鐵培養(yǎng)(TSI )降解葡萄糖會產(chǎn)生酸氣，不降解乳糖、蔗糖，有動力，產(chǎn)生黑色沉淀。 (3)生化反應(yīng)：沙門氏菌的生化反應(yīng)特性，葡萄糖乳糖麥芽糖醇蔗糖-吲哚V-P硫化氫

9、尿素酶氰化鉀-賴氨酸動力，、(4)血清學(xué)反應(yīng)，如果以可疑菌為抗原發(fā)生凝聚反應(yīng)， 如果沒有發(fā)生表明該菌可能是沙門氏菌的凝聚反應(yīng)，則將菌液在100水浴中煮沸30分鐘后(以破壞菌體外h抗原為目的)，進(jìn)行凝聚反應(yīng)，可以根據(jù)形態(tài)、菌落以及生化反應(yīng)的結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。 表21-2沙門氏菌檢查結(jié)果，血清凝集試驗(A-F組抗o血清)號凝集反應(yīng)10030分凝集反應(yīng)陽性2陰性陽性3陰性0.9%氯化鈉溶液對照生化試驗的結(jié)果，陰性一致檢測沙門氏菌陰性一致檢測沙門氏菌不一致，3，綠膿菌，尤其是大面積燒傷、燒傷感染該菌后病情加重，患者傷口化膿，嚴(yán)重者常引起敗血癥，眼角膜潰瘍失明。 因此，不能像眼科制劑和外傷藥那樣檢測出這

10、種菌。 檢查要點： (1)形態(tài)：革蘭陰性短桿菌(2)分離培養(yǎng)：十六烷基溴化銨瓊脂板上菌落扁平、不定形、濕潤、周邊擴(kuò)散或擴(kuò)散，灰白色，水溶性綠色色素擴(kuò)散至培養(yǎng)基。 (3)生化反應(yīng)：氧化酶試驗陽性、綠膿菌試驗陽性可報告檢出該菌。 如果綠膿菌實驗陰性，就需要明膠液化試驗陽性、硝酸鹽實驗陽性、42生長試驗陽性，受檢品有該菌報道。 4、金黃色葡萄球菌是葡萄球菌屬中致病力最強(qiáng)的菌，是人食物中毒癥的常見病原體，可引起人體局部化膿感染，重癥病例可引起敗血癥。 目前眼科制劑和外用藥規(guī)定不可檢測該菌。 檢查要點： (1)形態(tài)：革蘭氏陽性球菌，葡萄狀排列。 (2)分離培養(yǎng)和生化試驗蛋黃高鹽培養(yǎng)基甘露醇高鹽培養(yǎng)基菌落

11、特征金黃色、圓形突起金黃色、圓形突起邊緣整齊、邊緣整齊的周邊乳濁圈周邊有黃色環(huán)生化試驗甘露醇血漿凝固酶，以5、破傷風(fēng)桿菌、植物根、莖為原料的藥品多受破傷風(fēng)梭菌的污染。 感染該菌可引起破傷風(fēng)，死亡率達(dá)50%以上。 因此，用于深部組織、創(chuàng)傷和潰瘍面的外用藥不能檢測該菌。 檢查要點：(1)形態(tài)：克陽性芽胞梭菌，菌體細(xì)長，帶芽胞菌體呈鼓槌狀，有周鞭毛，可運動，不形成莢膜。 (2)分離培養(yǎng)：葡萄糖皰肉培養(yǎng)基，消化肉渣，使肉渣變黑，有特殊臭味。 新霉素葡萄糖血平板上菌落擴(kuò)散生長，呈霧狀、細(xì)絲狀或羽毛狀，邊緣不齊，常有溶血環(huán)。 (3)毒性試驗：大鼠批次注射菌液，648觀察發(fā)病情況。 出現(xiàn)典型破傷風(fēng)病并判定陽性。 為了證明小鼠是否為破傷風(fēng)外