第7章蛋白質的分離純化和表征.ppt

1、Protein，第7章蛋白質的分離純化和表征，蛋白質含有酸/堿的AA殘基，兩性堿/酸越大pI越大，pI通常為6.0左右，一方面，在蛋白質的兩性電離和等電點，蛋白質的分子量一般在1萬到百萬達爾頓之間的1達爾頓1C12 由化學組成測定最小分子量，1、測定蛋白質中某微量元素的含量，2、假定蛋白質中僅含有一個鐵原子的最低相對分子量=100* 55.8/鐵的含量，(SDSPAGE測定相對分子量，蛋白質粒子電泳時的遷移率依賴于帶電荷遷移率與電荷和形狀無關，只依賴于相對分子質量，巰基乙醇破壞了二硫化物鍵，(三)凝膠過濾法測定相對分子質量，凝膠化法只適合球狀蛋白分子的測定，三、蛋白質的膠體性和蛋白質的沉淀，(

2、一)膠體性(。 膠體溶液的特點：分子直徑在1-100 nm以內(nèi)溶于水難以凝聚沉淀的多數(shù)球狀蛋白質可以形成穩(wěn)定的親水性膠體溶液，蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定因子：1.同種蛋白質具有同種電荷，相互排斥2 .水膜彈性蛋白質溶液具有丁達效應， (2)蛋白質沉淀Pr從膠體溶液中析出可逆沉淀：溫和的條件、溶液pH和Pr帶電的電荷Pr的結構和性質不發(fā)生變化、在適當?shù)臈l件下進行非改性沉淀pI沉淀法， 鹽析法和有機溶劑沉淀法等能夠再溶解的不可逆沉淀的強沉淀條件破壞Pr膠體溶液的穩(wěn)定性，不能再溶解Pr結構和性質沉淀的改性沉淀，例如加熱沉淀、強酸/堿沉淀、重金屬鹽和生物堿沉淀等，1 .鹽析法加入中性鹽除去蛋白質的水合層，

3、鹽析一般不發(fā)生變性，等電點沉淀的蛋白質溶液中加入NaCl使鹽溶解原因沉淀的鹽溶鹽析、鹽析、蛋白質溶液中加入大量硫酸銨則蛋白質析出的原因是，2 .降低有機溶劑沉淀脫水化層及介電常數(shù)，增加帶電質點間的相互作用3 .等電點沉淀4 .形成重金屬鹽沉淀和帶負電荷蛋白質的不溶性鹽5 .生成生物堿試劑和一部分酸類沉淀和帶正電荷的蛋白質的不溶性鹽6 .加熱改性沉淀天然結構崩潰，疏水性基露出，破壞水化層和帶電狀態(tài)。 四、蛋白質分離純化的一般原則，總目標：產(chǎn)品純度的增加或比活1 .預處理：因動態(tài)/植物/細菌而異2 .粗分級分離：采用鹽析/等電點沉淀/有機溶劑分級分離等方法3 .細分級分離：凝膠過濾、離子交換色譜、吸附(1)分子大小不同的純化利用蛋白質分子無法透過半透膜，將小分子物質和半透膜用玻璃紙或纖維素材料、血液透析、小分子帶出，透析機、透析液、加壓、血液、2、密度梯度(區(qū)帶)。 (二)利用溶解度差的純化方法，1 .等電點沉淀調節(jié)溶液pH不同的蛋白質在各自的pI下依次沉淀2 .鹽溶和鹽析，3 .有機溶劑分級分離法，降低介電常數(shù)爭奪水合膜，(三)電荷不同的分離方法的電泳，原理：蛋白質在非等電點不帶電(4)